Luận án Nghiên cứu biểu hiện gen GmCHI1A liên quan đến tổng hợp isoflavone phân lập từ cây đậu tương (Glycine max (L.) Merill)”

Tên luận án:

Nghiên cứu biểu hiện gen GmCHI1A liên quan đến tổng hợp isoflavone phân lập từ cây đậu tương (Glycine max (L.) Merill)

Ngành:

Sinh học

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Luận án tập trung nghiên cứu cơ chế biểu hiện gen GmCHI1A và ảnh hưởng của nó đến hàm lượng isoflavone trong cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill). Isoflavone, một loại flavonoid quan trọng trong hạt đậu tương, có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe như chống oxy hóa, chống ung thư, kháng khuẩn và chống viêm. Mặc dù isoflavone dạng aglucone trong đậu tương được hấp thu tốt, hàm lượng của chúng thường thấp, tạo động lực cho các nghiên cứu cải thiện.

Enzyme chalcone isomerase (CHI) đóng vai trò then chốt trong con đường sinh tổng hợp isoflavone. Gen GmCHI1A ở đậu tương thuộc loại CHI II, và các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc tăng cường biểu hiện gen CHI có thể làm tăng đáng kể hàm lượng isoflavonoid. Tuy nhiên, chưa có công trình nào đi sâu vào việc phân tích biểu hiện gen GmCHI1A trực tiếp trên cây đậu tương nhằm tạo dòng cây chuyển gen có hàm lượng isoflavone cao.

Mục tiêu chính của luận án là biểu hiện thành công gen GmCHI1A trên cây đậu tương chuyển gen và tạo ra các dòng cây có hàm lượng isoflavone cao hơn đáng kể so với cây đối chứng. Để đạt được mục tiêu này, nghiên cứu đã tiến hành khảo sát đặc điểm gen GmCHI1A, bao gồm phân tích hàm lượng isoflavone ở các giống đậu tương phổ biến, nhân bản và giải trình tự gen GmCHI1A từ giống có hàm lượng cao. Tiếp theo, luận án đã thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen GmCHI1A và đánh giá hoạt động của vector này. Cuối cùng, nghiên cứu tập trung vào phân tích biểu hiện gen GmCHI1A trên cây đậu tương chuyển gen thông qua các kỹ thuật PCR, Southern blot, Western blot và ELISA, đồng thời đánh giá sự thay đổi hàm lượng isoflavone.

Những đóng góp mới của luận án bao gồm việc lần đầu tiên ở Việt Nam và trên thế giới chứng minh được sự biểu hiện mạnh của gen GmCHI1A làm tăng hàm lượng isoflavone trong mầm hạt đậu tương chuyển gen. Luận án đã phân lập thành công gen GmCHI1A từ cây đậu tương Việt Nam, có kích thước vùng mã hóa 657 nucleotide. Đặc biệt, nghiên cứu đã tạo ra 4 dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T2 với hàm lượng daidzein tăng từ 166,46% đến 187,23% và genistein tăng từ 329,80% đến 463,93% so với cây không chuyển gen.

Về mặt khoa học, kết quả này cung cấp cơ sở vững chắc cho việc cải thiện hàm lượng các hợp chất thứ cấp trong cây trồng bằng kỹ thuật biểu hiện gen. Về mặt thực tiễn, các dòng đậu tương chuyển gen GmCHI1A có tiềm năng trở thành vật liệu quý giá cho công tác chọn giống, cũng như ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng nhằm nâng cao sức khỏe cộng đồng.

Mục lục chi tiết:

Luận án có 139 trang (kể cả phụ lục), được chia thành các chương, phần:

• Mở đầu (5 trang)
• Chương 1: Tổng quan tài liệu (36 trang)
  • Tổng kết 126 tài liệu và một số trang web, trong đó có 17 tài liệu tiếng Việt, 109 tài liệu tiếng Anh về ba vấn đề cơ bản:
    • Cây đậu tương và isoflavone trong hạt đậu tương
    • Enzyme CHI và gen mã hoá CHI
    • Chuyển gen ở đậu tương và phân tích biểu hiện gen CHI
• Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (15 trang)
  • Các giống đậu tương sử dụng trong nghiên cứu: ĐT51, ĐT26, DT90, DT84, DT2008
  • Các vector và chủng vi khuẩn: pBT, pRTRA7/3, pCB301; E.coli DH5α, Agrobacterium tumefaciens CV58
  • Các cặp mồi PCR sử dụng: CHI-NcoI-F/CHI-NotI-R; CHI-NcoI-F/ CHI-SacI-R; nptII-F/nptII-R; pUC18-F/pUC18-R
  • Hóa chất: Kít thao tác phân tử, enzyme, các loại kháng sinh
  • Thiết bị: Máy PCR System 9700, máy điện di Powerpac300, máy soi DNA, máy Voltex, máy ly tâm, máy xung điện Plulser, máy NanoDrop, máy giải trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer
  • Các nhóm phương pháp nghiên cứu:
    • Nhóm phương pháp phân tích hàm lượng isoflavone (Định lượng daidzein và genistein theo AOAC Official 2008.03 và Chen và cs (2001))
    • Nhóm phương pháp phân lập gen (Thiết kế cặp mồi PCR nhân gen GmCHI1A, Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA, Nhân bản gen GmCHI1A, Điện di kiểm tra, Tách dòng và xác định trình tự gen GmCHI1A, Phân tích trình tự gen)
    • Nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật
    • Nhóm phương pháp phân tích hoạt động của vector chuyển gen trên cây thuốc lá (Biến nạp cấu trúc mang gen chuyển GmCHI1A thông qua A. tumefaciens vào mảnh lá và tái sinh cây thuốc lá chuyển gen, Tách chiết DNA tổng số, Xác định sự có mặt của gen chuyển GmCHI1A bằng PCR, Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển GmCHI1A ở mức phiên mã bằng kỹ thuật RT-PCR)
    • Nhóm phương pháp biến nạp và phân tích cây đậu tương chuyển gen (Phương pháp chuyển gen ở đậu tương nhờ A.tumefaciens qua nách lá mầm, Xác nhận sự hiện diện và hợp nhất của gen chuyển vào hệ gen cây đậu tương bằng PCR và Southern blot, Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp rCHI1A bằng Western blot và ELISA)
    • Phân tích, xử lý số liệu (Sử dụng Microsoft Excel, SPSS; Kiểm định trị số thống kê theo Duncan)
  • Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Thực phẩm - Viện Kiểm nghiệm và vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia Hà Nội, Phòng thí nghiệm Di truyền học, Công nghệ tế bào thực vật, Khoa...
• Chương 3: Kết quả và thảo luận (43 trang)
• Kết luận và đề nghị (2 trang)
• Các công trình công bố liên quan đến luận án (2 trang)
• Tài liệu tham khảo (16 trang)
• Phụ lục (6 trang)

Luận án có 14 bảng, 36 hình, 3 phụ lục và tham khảo 126 tài liệu và một số trang web.