Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis
Vi sinh y học, Công nghệ sinh học
Luận án này tập trung vào việc phát triển một kỹ thuật multiplex PCR (mPCR) tiên tiến để phát hiện nhanh chóng và chính xác đồng thời hai tác nhân gây bệnh nguy hiểm là Bacillus anthracis (gây bệnh than) và Yersinia pestis (gây bệnh dịch hạch). Hai loài vi khuẩn này từng là nỗi kinh hoàng trong lịch sử và có tiềm năng bị lợi dụng làm vũ khí sinh học; chúng vẫn tồn tại rải rác ở Việt Nam, đặt ra yêu cầu cấp thiết về khả năng ứng phó nhanh trong phòng chống dịch bệnh và khủng bố sinh học.
Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn, dù được xem là "tiêu chuẩn vàng", lại tốn thời gian (2-3 ngày), đòi hỏi điều kiện an toàn sinh học cấp 3 (BSL-3) và đôi khi thiếu độ đặc hiệu. Các que thử nhanh miễn dịch tiện lợi nhưng độ nhạy và đặc hiệu thấp, khó ứng dụng trên thực địa. Các kỹ thuật PCR hiện có tuy nhanh và chính xác hơn, nhưng thường chỉ phát hiện một loại plasmid độc lực, có thể bỏ sót các chủng thiếu một trong các plasmid này, dẫn đến chẩn đoán không đầy đủ về độc lực.
Để khắc phục những hạn chế trên, luận án đã nghiên cứu và phát triển thành công kỹ thuật mPCR đầu tiên ở Việt Nam có khả năng khuếch đại đồng thời 7 sản phẩm từ 6 cặp mồi được thiết kế tối ưu. Cụ thể, kỹ thuật này phát hiện 3 gen đích của B. anthracis (vrrA trên nhiễm sắc thể, pagA trên plasmid pXO1, capA trên plasmid pXO2) và 3 gen đích của Y. pestis (ypo2088 trên nhiễm sắc thể, pla trên plasmid pPCP1, caf1 trên plasmid pMT1), cùng với 1 gen chứng nội tại là plasmid tái tổ hợp nhằm xác minh kết quả chẩn đoán và loại trừ âm tính giả.
Kỹ thuật mPCR này cung cấp một giải pháp chẩn đoán toàn diện hơn bằng cách phát hiện cả gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể và các gen độc lực trên plasmid, giúp phân biệt chính xác các chủng gây bệnh đầy đủ độc lực. Điều này không chỉ giảm thiểu hiện tượng dương tính giả mà còn rút ngắn đáng kể thời gian và chi phí chẩn đoán so với việc thực hiện các phản ứng PCR riêng lẻ. Nghiên cứu đã tối ưu các thông số của mPCR như nồng độ mồi, MgCl2, dNTPs và nhiệt độ gắn mồi (56°C), đảm bảo hiệu quả cao và độ tin cậy trong phát hiện đồng thời hai tác nhân.