Luận án Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome hệ vi khuẩn dạ cỏ dê và khai thác, nghiên cứu tính chất của endo-xylanase

Tên luận án:

XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU DNA METAGENOME HỆ VI KHUẨN DẠ CỎ DÊ VÀ KHAI THÁC, NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENDO-XYLANASE

Ngành:

Hóa sinh học

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Luận án này tập trung vào việc tận dụng lignocellulose, một nguồn năng lượng tái tạo dồi dào nhưng chưa được khai thác hiệu quả, bằng cách chuyển hóa chúng thành nhiên liệu sinh học thông qua các phương pháp sinh học thân thiện với môi trường. Nghiên cứu xác định tầm quan trọng của việc tìm kiếm các enzyme lignocellulase có hoạt tính mạnh từ các nguồn tiềm năng, đặc biệt là hệ vi khuẩn dạ cỏ của dê nuôi ở Việt Nam, một hệ sinh thái mini chưa được nghiên cứu sâu, nơi 99% vi sinh vật không thể nuôi cấy được. Để khắc phục hạn chế này, kỹ thuật metagenomics đã được sử dụng để nghiên cứu trực tiếp DNA đa hệ gene vi khuẩn.

Mục tiêu chính của luận án là xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome của hệ vi khuẩn dạ cỏ dê, đồng thời biểu hiện và nghiên cứu tính chất của một endo-xylanase được mã hóa từ gene chức năng phân giải lignocellulose. Các nội dung nghiên cứu bao gồm giải mã DNA đa hệ gene của vi khuẩn trong dạ cỏ dê với dung lượng thông thường (8-10 Gb) và dung lượng lớn (45-50 Gb), xây dựng cơ sở dữ liệu và đánh giá đa dạng vi khuẩn. Luận án cũng khai thác gene và thiết lập công cụ mô hình Markov ẩn (HMM) để chú giải chức năng gene mã hóa enzyme/protein tham gia chuyển hóa lignocellulose, sau đó lựa chọn, biểu hiện và xác định đặc điểm của endo-xylanase.

Kết quả cho thấy, DNA đa hệ gene của vi khuẩn trong dạ cỏ dê đã được giải mã với dung lượng sâu 48,66 Gb, tạo ra 3.411.867 contig với độ phủ 64,22%. Tổng cộng 5.367.270 gene đã được chú giải, trong đó 4.311.093 gene (80,32%) được phân loại, chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn (99,8%). Ngành Bacteroidetes chiếm tỷ lệ lớn nhất (45,29%), tiếp theo là Firmicutes (30,38%), và chi Prevotella là chi chiếm tỷ lệ lớn nhất (25,79%). Từ dữ liệu giải mã sâu, 65.443 gene mã hóa cho 30 enzyme/protein liên quan đến quá trình phân hủy lignocellulose đã được xác định, trong đó Prevotella đóng góp đáng kể (27%) vào quá trình này. Một công cụ mô hình HMM mới đã được thiết kế thành công để khai thác hiệu quả các gene liên quan đến chuyển hóa lignocellulose.

Đặc biệt, 739 gene hoàn chỉnh mã hóa cho endo-xylanase đã được tìm thấy, với 108 trình tự có nguồn gốc từ Prevotella. Trình tự denovogenes_5086 mã hóa cho endo-xylanase GH10-CE1 đã được lựa chọn, tối ưu mã bộ ba và biểu hiện thành công trong E. coli. Enzyme tinh sạch có độ tinh sạch trên 95%, hoạt tính tối ưu ở 40°C và pH 5,5, bền nhiệt ở nhiệt độ tối ưu nhưng mất hoạt tính nhanh chóng ở 60°C. Enzyme hoạt động đặc hiệu trên cơ chất xylan và bị ức chế bởi một số ion kim loại và hóa chất. Các thông số động học của enzyme xylanase được xác định là Km = 14,56 mg/ml và Vmax = 0,86 µmol/phút với hoạt tính riêng đạt 171,56 IU/mg.