Luận án Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh

Tên luận án:

PHÂN LẬP ĐOẠN GEN CP TỪ SOYBEAN MOSAIC VIRUS VÀ PHÁT TRIỂN VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH

Ngành:

Di truyền học

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Luận án tập trung vào việc tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh khảm do virus thông qua kỹ thuật RNA interference (RNAi). Đậu tương là cây trồng có giá trị kinh tế cao nhưng năng suất và chất lượng thấp do nhiều yếu tố, trong đó các loại virus như Soybean mosaic virus (SMV) và Bean yellow mosaic virus (BYMV) gây bệnh khảm là nguyên nhân chính, có thể làm giảm năng suất tới 40% và ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng hạt. Các biện pháp phòng bệnh hiện tại còn hạn chế, và nguồn giống kháng bệnh tự nhiên khan hiếm. Kỹ thuật RNAi, dựa trên nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã, được xem là hướng tiếp cận hiệu quả để tạo cây kháng virus.

Mục tiêu chung của nghiên cứu là tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm bằng kỹ thuật RNAi. Các mục tiêu cụ thể bao gồm xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV ở Việt Nam, phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi kháng cả SMV và BYMV, tạo cây thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng cao hơn cây đối chứng, và tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi.

Nội dung nghiên cứu bao gồm thu thập thông tin, thiết kế mồi, tách dòng và phân tích trình tự đoạn gen CP của SMV, phân tích sự tương đồng của gen CP giữa SMV và BYMV để tổng hợp đoạn CPi bảo thủ. Sau đó, thiết kế và biến nạp vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn CPi vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, rồi chuyển cấu trúc này vào cây thuốc lá và cây đậu tương để đánh giá tính kháng bệnh.

Luận án đã phân lập thành công đoạn gen CP từ SMV dòng SL1 và SL2, phát triển hai vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đơn loài SMV và kháng đồng thời cả SMV và BYMV. Nghiên cứu cũng tạo được 19 dòng cây thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng cả hai loài virus SMV và BYMV (đạt 73,08% kháng hoàn toàn) và chuyển thành công cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương ĐT12 và DT2008, thu được 5 dòng từ ĐT12 và 19 dòng từ DT2008. Kết quả này khẳng định cơ sở khoa học và tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng kháng virus, mở ra triển vọng ứng dụng trong chọn tạo giống đậu tương kháng bệnh tại Việt Nam.

Mục lục chi tiết:

• 1. Đặt vấn đề

• 2. Mục tiêu nghiên cứu

  • 2.1. Mục tiêu chung

  • 2.2. Mục tiêu cụ thể

• 3. Nội dung nghiên cứu

  • 3.1. Thu thập thông tin về hệ gen và gen CP của SMV, thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen CP, tách dòng và xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV. Phân tích sự đa dạng về trình tự đoạn gen CP, trình tự amino acid suy diễn của gen CP phân lập từ SMV ở Việt Nam và một số trình tự đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế.

  • 3.2. Phân tích sự tương đồng của gen CP trong hệ gen của SMV và BYMV phân lập từ nhiều nguồn khác nhau. Xác định đoạn bảo thủ của gen CP và tổng hợp nhân tạo đoạn CPi từ thông tin về gen CP.

  • 3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và của hai loài SMV và BYMV bằng kỹ thuật Gateway. Biến nạp vector chuyển gen mang đoạn gen CPi đã thiết kế vào A. tumefaciens.

  • 3.4. Biến nạp cấu trúc RNAi vào cây thuốc lá. Phân tích sự có mặt của đoạn gen CPi của hai loài SMV và BYMV trên cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR. Đánh giá tính kháng đối với SMV và BYMV của cây chuyển gen so với cây đối chứng không chuyển gen.

  • 3.5. Chuyển cấu trúc RNAi vào cây đậu tương thông qua A. tumefaciens. Phân tích, xác định sự có mặt của đoạn gen chuyển CPi trên cây đậu tương chuyển gen.

• 4. Những đóng góp mới của luận án

  • 4.1. Phân lập được đoạn gen CP từ SMV dòng SL1 và SL2 có kích thước 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid. Hai trình tự đoạn gen CP của SMV đã được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102, HG965103.

  • 4.2. Phát triển thành công hai vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng đơn loài SMV và khả năng kháng đồng thời hai loài SMV và BYMV.

  • 4.3. Tạo được 19 dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng cả hai loài SMV và BYMV.

  • 4.4. Chuyển thành công cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương ĐT12 và DT2008, thu được 5 dòng cây chuyển gen từ giống ĐT12 và 19 dòng cây chuyển gen từ giống DT2008.

• 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

  • 5.1. Về khoa học

  • 5.2. Về thực tiễn

• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

  • 1. KẾT LUẬN

    • 1.1. Tách dòng và xác định được trình tự đoạn gen CP từ SMV dòng SL1, SL2. Đoạn gen CP phân lập được có 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid, trong đó số amino acid của vùng poty-coat là 208. Trình tự đoạn gen CP của SMV dòng SL1 và dòng SL2 đã được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102, HG965103. SMV dòng SL1, SL2 phân bố cùng nhóm với hai dòng của Trung Quốc.
    • 1.2. Phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi kháng đơn loài SMV và vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi kháng đồng thời hai loài SMV và BYMV. Tạo được chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc RNAi này.
    • 1.3. Tạo được 26 dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi [CPi (SMV-BYMV)] có kết quả dương tính với phản ứng PCR, trong đó có 19/26 dòng cây thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn đồng thời cả SMV và BYMV (chiếm 73,08%).
    • 1.4. Đã chuyển thành công cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào hai giống đậu tương ĐT12 và DT2008. Thu được 5 dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 từ giống ĐT12 và 19 dòng cây chuyển gen từ giống DT2008 dương tính với phản ứng PCR, hiệu suất chuyển gen đạt lần lượt là 1,35% và 2,24%.

  • 2. ĐỀ NGHỊ

    • 2.1. Cần tiếp tục chọn lọc, phân tích biểu hiện tính kháng đơn loài SMV và tính kháng đồng thời cả hai loài SMV và BYMV ở thế hệ đậu tương chuyển gen T1 và các thế hệ tiếp theo phục vụ công tác chọn giống đậu tương kháng virus.
    • 2.2. Nghiên cứu thiết kế cấu trúc RNAi chứa đồng thời hai hoặc một vài gen của SMV, BYMV để tăng hiệu quả kháng virus của cây đậu tương chuyển gen.