Luận án Nghiên cứu tạo kháng nguyên S của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn (PEDV) trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana có tính sinh miễn dịch định hướng tạo vacxin thế hệ mới

Tên luận án:

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN S CỦA VIRUS GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP Ở LỢN (PEDV) TRÊN CÂY THUỐC LÁ NICOTIANA BENTHAMIANA CÓ TÍNH SINH MIỄN DỊCH ĐỊNH HƯỚNG TẠO VACXIN THẾ HỆ MỚI

Ngành:

Công nghệ Sinh học

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Luận án này tập trung vào bệnh tiêu chảy cấp ở lợn (PED), một bệnh nguy hiểm do virus PEDV gây ra, có khả năng lây lan rộng và ảnh hưởng nghiêm trọng đến kinh tế. Các vacxin hiện tại cho thấy hiệu quả bảo hộ thấp chống lại các chủng PEDV G2 mới do sự khác biệt trong trình tự bộ gen. Nghiên cứu này hướng tới phát triển vacxin tiểu đơn vị thế hệ mới sử dụng hệ thống biểu hiện trên thực vật, cụ thể là cây thuốc lá Nicotiana benthamiana, với các ưu điểm như chi phí sản xuất thấp, dễ dàng nhân rộng, độ ổn định cao và thời hạn sử dụng lâu dài. Phương pháp biểu hiện tạm thời trên thực vật cũng cho phép sản xuất protein tái tổ hợp nhanh chóng để ứng phó kịp thời với dịch bệnh.

Mục tiêu chính của luận án là tạo ra các kháng nguyên S tái tổ hợp của PEDV từ N. benthamiana và đánh giá tính sinh miễn dịch của chúng trên động vật thí nghiệm, nhằm phát triển vacxin. Các nội dung nghiên cứu bao gồm việc tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a-pII từ chủng PEDV nhóm G1a, cũng như COE/G2a-pII, COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII từ chủng PEDV nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam.

Các đóng góp mới của luận án bao gồm việc nghiên cứu một cách hệ thống về tạo kháng nguyên COE tái tổ hợp từ chủng PEDV DR13 (nhóm G1a) và các kháng nguyên COE, COE-S1D, S2 tái tổ hợp từ chủng NAVET/PEDV/PS6/2010 (nhóm G2a) trên N. benthamiana bằng công nghệ biểu hiện tạm thời, đồng thời đánh giá đáp ứng miễn dịch của chúng trên động vật thử nghiệm. Kết quả cho thấy kháng nguyên COE/G2a-pII tiêm cho lợn nái có khả năng bảo vệ lợn con chống lại PEDV sau công cường độc. Kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII kết hợp chất bổ trợ Emulsigen®-D đã kích thích đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu PEDV mạnh hơn và sinh đáp ứng kháng thể IgA đặc hiệu PEDV có khả năng trung hòa PEDV tương đương vacxin thương mại. Các protein tái tổ hợp này thể hiện tính kháng nguyên cao và khả năng sinh miễn dịch tốt, là những ứng viên vacxin đầy triển vọng để phòng chống PED tại Việt Nam.

Mục lục chi tiết:

• Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

  • 1.1. Bệnh tiêu chảy cấp ở lợn
    • 1.1.1. Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới
    • 1.1.2. Tình hình dịch bệnh PED tại Việt Nam
  • 1.2. Tác nhân gây bệnh của PED
    • 1.2.1. Phân loại PEDV
    • 1.2.2. Đặc điểm hình thái của PEDV
    • 1.2.3. Đặc điểm cấu trúc hệ gen và chức năng của các protein PEDV
    • 1.2.4. Protein S của PEDV
    • 1.2.5. Dịch tễ học phân tử các chủng PEDV trên thế giới
    • 1.2.6. Dịch tễ học phân tử của các chủng PEDV tại Việt Nam
  • 1.3. Vacxin phòng PEDV
    • 1.3.1. Vacxin bất hoạt và vacxin nhược độc
    • 1.3.2. Vacxin tiểu đơn vị
    • 1.3.3. Vacxin axit nucleic
    • 1.3.4. Các vấn đề tồn tại trong phát triển vacxin phòng chống PEDV
  • 1.4. Vacxin tiểu đơn vị có nguồn gốc từ thực vật
    • 1.4.1. Hệ thống biểu hiện tạm thời trên thực vật
    • 1.4.2. Vacxin từ thực vật phòng chống PEDV trên thế giới
    • 1.4.3. Motif GCN4pII và motif tailpiece của IgM
      • 1.4.3.1. Motif GCN4pII
      • 1.4.3.2. Motif tp của IgM
    • 1.4.4. Vacxin từ thực vật phòng chống các bệnh thú y tại Việt Nam

• Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

  • 2.1. Vật liệu
    • 2.2.1. Chủng vi sinh vật, tế bào, plasmid và trình tự gen
    • 2.1.2. Mồi
    • 2.1.3. Nguồn vật liệu thực vật
    • 2.1.4. Nguồn vật liệu động vật
    • 2.1.5. Hóa chất
    • 2.1.6. Thiết bị và vật tư
  • 2.2. Phương pháp

• Chương 3. KẾT QUẢ

  • 3.1. Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G1a
    • 3.1.1. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên COE/G1a-pII và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng
    • 3.1.2. Biểu hiện kháng nguyên COE/G1a-pII tạm thời trong lá thuốc lá N. benthamiana
    • 3.1.3. Tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của kháng nguyên COE/G1a-pII
    • 3.1.4. Đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a-pII tái tổ hợp trên chuột
  • 3.2. Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam
    • 3.2.1. Thu thập thông tin, lựa chọn và tách dòng gen mã hóa protein S của chủng PEDV gây bệnh tại Việt Nam
    • 3.2.2. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên COE/G2a-pII và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng
    • 3.2.3. Biểu hiện kháng nguyên COE/G2a-pII tạm thời trong lá thuốc lá N. benthamiana
    • 3.2.4. Tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của kháng nguyên COE/G2a-pII
      • 3.2.4.1. Tinh sạch kháng nguyên COE/G2a-pII bằng IMAC
      • 3.2.4.2. Tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của kháng nguyên COE/G2a-pII bằng SEC và phản ứng liên kết chéo
    • 3.2.5. Đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a-pII trên lợn
      • 3.2.5.1. Đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a-pII trên lợn nái mang thai sau tiêm
      • 3.2.5.2. Đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng cytokine ở lợn con được sinh ra từ lợn nái sau tiêm
      • 3.2.5.3. Đáp ứng miễn dịch bảo hộ lợn con chống lại chủng PEDV G2a có độc lực cao
  • 3.3. Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam
    • 3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa các kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp, S2/G2a-pII và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng
    • 3.3.2. Biểu hiện các kháng nguyên tái tổ hợp COE-S1D/G2a-pII, COE-pII-tp và S2/G2a-pII tạm thời trong lá thuốc lá N. benthamiana
    • 3.3.3. Tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của các kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII tái tổ hợp
    • 3.3.4. Đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII trên chuột
    • 3.3.5. Đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII trên lợn

• Chương 4. THẢO LUẬN

  • 4.1. Mức độ biểu hiện và khả năng thu hồi của các kháng nguyên tái tổ hợp từ lá thuốc lá N. benthamiana
  • 4.2. Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a-pII trên chuột
  • 4.3. Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a pII trên lợn nái và khả năng bảo hộ lợn con chống lại chủng PEDV G2a độc lực cao
  • 4.4. So sánh tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII với kháng nguyên COE/G2a-pII trên chuột
  • 4.5. So sánh tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII với kháng nguyên COE/G2a-pII trên lợn con

• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

  • KẾT LUẬN
  • KIẾN NGHỊ