Luận án Nghiên cứu tạo dòng và tối ưu điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp

Tên luận án:

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TRONG Bacillus subtilis BD170 TÁI TỔ HỢP

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Luận án "Nghiên cứu tạo dòng và tối ưu điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp" được thực hiện nhằm cung cấp nguồn dược chất tự nhiên cho các ứng dụng y dược học. Đề tài xuất phát từ tính cấp thiết của việc tìm kiếm giải pháp cho các bệnh tim mạch và nhồi máu cơ tim, nơi sự mất cân bằng giữa tích tụ và phân hủy fibrin gây tắc nghẽn mạch máu. Nattokinase, một enzyme có khả năng phân giải fibrin, là đối tượng nghiên cứu chính.

Nghiên cứu đã phân lập thành công gen mã hóa nattokinase (nat05 và natC10) từ hai chủng Bacillus subtilis tự nhiên N05 và C10, với chiều dài 1146 bp và độ tương đồng cao (98,17% và 99,65%) so với gen aprN đã biết. Các gen này sau đó được tạo dòng vào vector biểu hiện pHT43 và biến nạp thành công vào chủng Bacillus subtilis BD170.

Kết quả cho thấy cả hai gen nat05 và natC10 đều được biểu hiện thành công trong Bacillus subtilis BD170. Đặc biệt, dòng tái tổ hợp R4 mang gen nat05 thể hiện hoạt tính protease và khả năng thủy phân fibrin mạnh nhất. Enzyme nattokinase tái tổ hợp từ dòng R4 có khối lượng phân tử khoảng 27,5 kDa, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 37°C và pH 9, cho thấy đặc tính của một protease kiềm. Hoạt tính enzyme bị giảm bởi các ion Ca²⁺, Cu²⁺, Tween 20 và SDS, nhưng tăng đáng kể khi có mặt Triton X-100. Đáng chú ý, enzyme Nat05 tái tổ hợp thể hiện khả năng phân giải cục máu đông thỏ chỉ sau khoảng 15 phút xử lý.

Quy trình tinh sạch nattokinase bằng hệ hai pha nước PEG/potassium phosphate đã được tối ưu. Hệ có thành phần 30% PEG 2000 và 15% potassium phosphate cho hiệu suất tinh sạch tốt nhất với hệ số phân tách K_nattokinase đạt 11,47, hoạt độ riêng SA_nattokinase là 797,17 U/mg và hiệu suất thu hồi Y_nattokinase đạt 95,38%. Sản phẩm tinh sạch có chất lượng khá tốt với hoạt tính phân giải fibrin rõ rệt.

Những kết quả này khẳng định tiềm năng của nattokinase tái tổ hợp từ Bacillus subtilis BD170 như một dược chất tự nhiên, mở ra hướng nghiên cứu tiếp theo về ứng dụng trong phân hủy huyết khối và sản xuất ở quy mô pilot.

Mục lục chi tiết:

• MỞ ĐẦU

  • 1. Tính cấp thiết của đề tài

• Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

  • 1.1. GIỚI THIỆU VỀ NATTOKINASE
    • 1.1.1. Đặc điểm của nattokinase
    • 1.1.2. Nguồn sản xuất nattokinase
    • 1.1.3. Ứng dụng của nattokinase
  • 1.2. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN BACILLUS SUBTILIS
    • 1.2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
    • 1.2.2. Hệ thống vector biểu hiện ở Bacillus
  • 1.3. TINH SẠCH ENZYME BẰNG HỆ 2 PHA NƯỚC

• Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

  • 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
  • 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
    • 2.2.1. Phân lập gen mã hóa nattokianse từ các chủng B. subtilis C10 và N05
    • 2.2.2. Tạo dòng gen mã hóa nattokinase trong tế bào E. coli TOP10
    • 2.2.3. Biến nạp vector pHT43/natC10 và pHT43/nat05 vào Bacillus subtilis BD170
    • 2.2.4. Biểu hiện nattokinase bằng hệ thống vector pHT43
    • 2.2.5. Xác định hoạt tính nattokinase
    • 2.2.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt tính phân giải fibrin
    • 2.2.7. Thử nghiệm khả năng phân giải fibrin trong máu thỏ bằng nattokinase tái tổ hợp
    • 2.2.8. Tinh sạch nattokinase tái tổ hợp bằng hệ hai pha nước
    • 2.2.9. Xử lý thống kê

• Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

  • 3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TỪ CÁC CHỦNG B. SUBTILIS
    • 3.1.1. Khuếch đại gen mã hóa nattokinase từ các chủng B. subtilis
    • 3.1.2. Tạo dòng gen nattokinase giả định trong vector pCR®2.1
    • 3.1.3. Xác định trình tự gen nattokinase giả định từ các chủng B. subtilis
  • 3.2. TẠO DÒNG GEN nat05 VÀ natC10 TRONG B. SUBTILIS BD170
    • 3.2.1. Tạo dòng gen nat05 và natC10 vào vector pHT43
    • 3.2.2. Biến nạp vector pHT43 tái tổ hợp vào B. subtilis BD170
  • 3.3. BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP TRONG B. SUBTILIS BD170
    • 3.3.1. Xác định dòng B. subtilis BD170 biểu hiện nattokinase mạnh
    • 3.3.2. Đặc điểm của nattokinase tái tổ hợp ở dòng R4
      • 3.3.2.1. Khối lượng phân tử
      • 3.3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
      • 3.3.2.3 Ảnh hưởng của pH
      • 3.3.3.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất hoạt động bề mặt
      • 3.3.3.4. Khả năng phân giải cục máu đông của nattokinase tái tổ hợp
  • 3.4. TINH SẠCH NATTOKINASE BẰNG HỆ HAI PHA NƯỚC
    • 3.4.1. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử PEG
    • 3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ potassium phosphate
    • 3.4.3. Thu hồi enzyme
    • 3.4.4. Xác định khối lượng phân tử của nattokinase tái tổ hợp

• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

  • 1. KẾT LUẬN
  • 2. KIẾN NGHỊ