Tên luận án:
NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA TÁI TỔ HỢP NHẰM TĂNG CƯỜNG HIỆU SUẤT TỔNG HỢP PYOCYANIN ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Ngành:
Công nghệ sinh học
Tóm tắt nội dung tài liệu:
Luận án này tập trung vào việc nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa tái tổ hợp nhằm tăng cường hiệu suất tổng hợp pyocyanin, một hoạt chất sinh học tự nhiên có đặc tính kháng khuẩn, không gây độc và có tiềm năng ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản để thay thế kháng sinh. Xuất phát từ thực trạng hiệu suất tổng hợp pyocyanin từ các chủng tự nhiên còn hạn chế, nghiên cứu đã đặt ra mục tiêu phân lập các chủng P. aeruginosa có khả năng sinh pyocyanin và tạo chủng tái tổ hợp mang thêm gen phzM và phzS để tăng cường tổng hợp pyocyanin. Đồng thời, nghiên cứu cũng tập trung vào việc xác định phương pháp chiết, thu hồi và đánh giá đặc điểm, hoạt tính kháng khuẩn của pyocyanin thu được, đặc biệt là khả năng kháng Vibrio gây bệnh trên tôm.
Trong quá trình nghiên cứu, 18 chủng vi khuẩn sinh pyocyanin đã được phân lập và sàng lọc, trong đó chủng P. aeruginosa PS39 được chọn lọc vì có khả năng tổng hợp pyocyanin cao nhất (15,02±0,56 µg/mL). Vector pUCP24-phzMS chứa hai gen phzM (1000 bp) và phzS (1200 bp) đã được thiết kế thành công, giải trình tự và kiểm tra biểu hiện trong tế bào E. coli trước khi biến nạp vào chủng P. aeruginosa PS39 để tạo ra chủng tái tổ hợp P. aeruginosa PS39-phzMS. Chủng tái tổ hợp này đã cho thấy khả năng tăng cường tổng hợp pyocyanin đáng kể, với nồng độ pyocyanin chiết xuất đạt 31,22 µg/mL, cao hơn gấp đôi so với chủng tự nhiên.
Phương pháp tách chiết và tinh chế pyocyanin cũng được nghiên cứu, với chloroform được xác định là dung môi hiệu quả nhất, cho sản phẩm pyocyanin tinh sạch 97% với công thức phân tử C13H10N2O. Pyocyanin chiết xuất từ chủng tái tổ hợp đã chứng minh khả năng ức chế mạnh các chủng Vibrio gây bệnh trên tôm (MIC 12,5 - 17,5 µg/mL, MBC 20 - 25 µg/mL) và các vi sinh vật kiểm định khác (Gram âm, Gram dương, nấm men). Cuối cùng, các điều kiện nuôi cấy tối ưu đã được xác định cho chủng P. aeruginosa PS39-phzMS, bao gồm môi trường GM (pH 8), nhiệt độ 30°C, tốc độ lắc 200 vòng/phút và thời gian 120 giờ, giúp đạt năng suất pyocyanin cao nhất 49,57±1,71 µg/mL. Luận án đã đóng góp mới bằng việc tạo chủng tái tổ hợp sản xuất pyocyanin hiệu quả hơn và tối ưu hóa quy trình sản xuất.
Mục lục chi tiết:
-
MỞ ĐẦU
- 1. Tính cấp thiết của luận án
- 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
- 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
-
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
- 1.1. Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa và pyocyanin
- 1.2. Chuyển gen mã hóa protein tham gia vào quá trình tăng sinh pyocyanin
- 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp pyocyanin bởi Pseudomonas aeruginosa
-
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- 2.1. Vật liệu và hóa chất
- 2.2. Phương pháp vi sinh vật
- 2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn sinh pyocyanin
- 2.2.2. Phương pháp nhuộm Gram và chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét
- 2.2.3. Định danh vi khuẩn theo các phương pháp sinh hóa
- 2.2.4. Xác định gen đặc trưng loài PA 956 của P. aeruginosa
- 2.2.5. Xây dựng cây phát sinh loài
- 2.2.6. Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào
- 2.3. Thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen
- 2.3.1. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn
- 2.3.2. Phương pháp điện di kiểm tra DNA
- 2.3.3. Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen phzM và phzS
- 2.3.4. Phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp pUCP24-phzMS
- 2.3.5. Kiểm tra sự biểu hiện của phzM, phzS trong E. coli
- 2.3.6. Tạo chủng tái tổ hợp P. aeruginosa PS39 mang plasmid pUCP24-phzMS
- 2.3.7. Kiểm tra sự có mặt của plasmid tái tổ hợp pUCP24-phzMS trong chủng tái tổ hợp
- 2.3.8. Giải trình tự plasmid pUCP24-phzMS để kiểm tra cassete biểu hiện phzMS bằng hệ thống giải trình tự thế hệ mới
- 2.3.9. Phương pháp bảo quản và nuôi cấy chủng giống
- 2.4. Phương pháp nghiên cứu tách chiết, tinh chế pyocyanin
- 2.4.1. Nuôi cấy chủng P. aeruginosa PS39-phzMS để thu dịch lên men cho tách chiết pyocyanin
- 2.4.2. Phương pháp định lượng pyocyanin
- 2.4.3. Phương pháp tách chiết và định lượng PCA
- 2.4.4. Lựa chọn dung môi tách chiết pyocyanin
- 2.4.5. Các phương pháp xác định độ tinh sạch của pyocyanin
- 2.5. Phương pháp xác định đặc tính kháng khuẩn của pyocyanin
- 2.5.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) và Vibrio
- 2.5.2. Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của pyocyanin
- 2.5.3. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
- 2.6. Phương pháp xác định điều kiện nuôi cấy chủng tái tổ hợp sinh pyocyanin
- 2.6.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy
- 2.6.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy
- 2.7. Phương pháp phân tích số liệu
-
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
- 3.1. Phân lập và sàng lọc vi khuẩn Pseudomonas sinh pyocyanin
- 3.2. Nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp P. aeruginosa PS39 mang thêm bản sao gen phzM và phzS trong plasmid
- 3.2.1. Phân lập, tách dòng gen phzM và phzS từ P. aeruginosa PS39
- 3.2.2. Thiết kế vector pUCP24-phzMS mang hai gen phzM và phzS
- 3.2.3. Kiểm tra khả năng biểu hiện của hai gen phzM và phzS trong vector tái tổ hợp pUCP24-phzMS
- 3.2.4. Tạo chủng P. aeruginosa PS39 tái tổ hợp mang vector pUCP24-phzMS
- 3.3. Nghiên cứu phương pháp thu hồi, tinh sạch pyocyanin từ P. aeruginosa PS39-phzMS
- 3.3.1. Chọn dòng P. aeruginosa PS39-phzMS sinh pyocyanin cao
- 3.3.2. Nghiên cứu tách chiết, tinh chế pyocyanin
- 3.4. Đặc tính kháng khuẩn của pyocyanin
- 3.4.1. Khả năng kháng các vi sinh vật kiểm định của pyocyanin
- 3.4.2. Đánh giá khả năng kháng Vibrio spp. gây bệnh trên tôm của pyocyanin
- 3.5. Nghiên cứu điều kiện nuôi thích hợp cho tăng sinh pyocyanin từ P. aeruginosa PS39-phzMS
- 3.5.1. Ảnh hưởng của các yếu tố hóa lý đến sinh tổng hợp pyocyanin bởi P. aeruginosa PS39-phzMS
- 3.5.2. Lựa chọn một số nguồn dinh dưỡng thích hợp cho sinh tổng hợp pyocyanin
-
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
- KẾT LUẬN
- KIẾN NGHỊ
- NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN