Luận án Nghiên cứu tạo cây đậu tương (Glycine max L.) biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin chuyên biệt ở hạt

Tên luận án:

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max L.) BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ASTAXANTHIN CHUYÊN BIỆT Ở HẠT

Ngành:

Công nghệ Sinh học

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Astaxanthin (C40H52O4), một carotenoid màu đỏ, được biết đến với nhiều tác dụng vượt trội trong chăm sóc và bảo vệ sức khỏe như chống oxy hóa, bảo vệ DNA, tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị tiểu đường, tim mạch và thần kinh. Hợp chất này cũng được sử dụng rộng rãi để tạo màu trong chăn nuôi và thủy sản. Nhu cầu và giá trị của astaxanthin tự nhiên trên thị trường hiện nay rất cao. Việc nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin vào các cây thực phẩm phổ biến như đậu tương (Glycine max L.) được xem là một hướng đi tiềm năng nhằm cung cấp các sản phẩm có giá trị kinh tế và ứng dụng cao, đặc biệt khi chưa có nghiên cứu tương tự nào được ghi nhận tại Việt Nam.

Mục tiêu chính của luận án là tạo ra các dòng cây đậu tương biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin chuyên biệt ở hạt và xác định hàm lượng astaxanthin trong các hạt đậu tương chuyển gen này. Để thực hiện, nghiên cứu đã áp dụng chiến lược chuyển ba gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp astaxanthin: gen Zm-psy (từ ngô) để tăng cường tổng hợp β-carotene, cùng với các gen cbfd2 và hbfd1 (từ cây hoa Adonis aestivalis) để chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin trong hạt. Gen bar được sử dụng làm yếu tố chọn lọc.

Nghiên cứu đã tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy mô để tái sinh chồi và rễ cho các giống đậu tương được chọn (MTĐ 176, HL 07-15, OMĐN 29), với nồng độ BA 2 mg/l cho tạo chồi và IBA 1-1,5 mg/l cho tạo rễ. Nồng độ PPT tối ưu để chọn lọc chồi chuyển gen cũng được thiết lập. Các phương pháp tạo vết thương mẫu như kim châm (3 lần), hoặc dao mổ kết hợp sóng siêu âm (30 giây) hoặc thấm hút chân không (60 giây) đã được cải tiến để nâng cao hiệu quả chuyển gen.

Kết quả luận án đã tạo ra thành công 2 dòng đậu tương biến đổi gen (D2 và D8) có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt. Phân tích sinh học phân tử bằng PCR và Southern blot xác nhận sự hiện diện và tích hợp ổn định của các gen chuyển (bar, cbfd2, hbfd1, Zm-psy) vào bộ gen cây. Các dòng chuyển gen D2-1 và D8-1 thể hiện tính kháng thuốc diệt cỏ Basta, chứng tỏ gen bar đã biểu hiện. Hàm lượng astaxanthin trong hạt thế hệ T1 của các dòng D2-1 và D8-1 lần lượt là 0,31 µg/g và 0,77 µg/g. Các gen biến nạp được di truyền và biểu hiện ổn định qua nhiều thế hệ. Luận án đã đóng góp vào việc tạo ra cây đậu tương phát triển bình thường, có khả năng sản xuất astaxanthin, và xây dựng quy trình chuyển gen hiệu quả cho giống đậu tương MTĐ 176, có tiềm năng ứng dụng cho các giống khác.

Mục lục chi tiết:

• MỞ ĐẦU

  • 1. Tính cấp thiết của đề tài
  • 2. Mục tiêu của đề tài
  • 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
  • 1.1. Chuyển gen tạo astaxanthin vào thực vật
  • 1.2. Nghiên cứu phát sinh hình thái và biến đổi gen đậu tương
  • 1.2.1. Nghiên cứu phát sinh hình thái ở đậu tương
  • 1.2.2. Chuyển gen vào đậu tương sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens
  • 1.3. Cách tiếp cận

• CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

  • 2.1. Vật liệu
  • 2.1.1. Giống đậu tương
  • 2.1.2. Chủng vi khuẩn, plasmid.
  • 2.1.3. Kim châm để tạo vết thương cho mẫu chuyển gen
  • 2.1.4. Môi trường nuôi cấy mô
  • 2.1.5. Các hóa chất khác
  • 2.1.6. Thiết bị sử dụng
  • 2.2. Nội dung và phương Pháp

  • Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và một nửa hạt.

    • 2.2.1. Tuyển chọn giống đậu tương
    • 2.2.2. Khử trùng hạt
    • 2.2.3. Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi của đốt lá mầm và một nửa hạt
    • 2.2.4. Ảnh hưởng của IBA lên sự tạo rễ của chồi in vitro

  • Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương

    • 2.2.5. Ảnh hưởng của PPT lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt
    • 2.2.6. Ảnh hưởng của PPT lên sự sinh trưởng của chồi in vitro
    • 2.2.7. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng kim châm lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm
    • 2.2.8. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương
    • 2.2.9. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp thấm hút chân không lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương

  • Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tương chuyển gen.

    • 2.2.10. Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST
    • 2.2.11. Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương
    • 2.2.11.1. Chuyển gen vào đốt lá mầm dùng kim châm và dao mổ tạo vết thương
    • 2.2.11.2. Chuyển gen vào đốt lá mầm, một nửa hạt dùng dao mổ, sóng siêu âm và thấm hút chân không tạo vết thương.
    • 2.2.12. Kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR
    • 2.2.13. Kiểm tra cây chuyển gen bằng Southern blot.
    • 2.2.14. Phân tích hàm lượng astaxanthin trong hạt
    • 2.2.15. Đánh giá các giai đoạn sinh trưởng cây chuyển gen trong điều kiện ex vitro
    • 2.2.16. Xử lý thống kê

• CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

  • Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và một nửa hạt.

    • 3.1. Tuyển chọn các giống đậu tương
    • 3.2. Hiệu quả của các phương pháp khử trùng hạt đậu tương
    • 3.3. Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt
    • 3.4. Ảnh hưởng của IBA lên sự tạo rễ của chồi in vitro

  • Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương

    • 3.5. Ảnh hưởng của PPT lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt
    • 3.6. Ảnh hưởng của PPT lên sự sinh trưởng của chồi in vitro
    • 3.7. Ảnh hưởng việc tạo vết thương bằng kim châm lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm
    • 3.8. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương
    • 3.9. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp thấm hút chân không lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương

  • Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tương chuyển gen.

    • 3.10. Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST
    • 3.11. Chuyển gen tạo cây đậu tương có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt
    • 3.11.1. Chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng kim châm tạo vết thương mẫu
    • 3.11.2. Chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens dùng dao mổ kết hợp sóng siêu âm, thấm chân không tạo vết thương mẫu
    • 3.11.2.1. Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương
    • 3.11.2.2. Kiểm tra sự hiện diện của gen biến nạp trên các dòng kháng PPT bằng phương pháp PCR
    • 3.11.2.3. Kiểm tra cây chuyển gen bằng Southern blot
    • 3.11.2.4. Kiểm tra tính kháng của cây chuyển gen với thuốc diệt cỏ Basta
    • 3.11.2.5. Kiểm tra sự di truyền của gen biến nạp
    • 3.11.2.6. Phân tích hàm lượng astaxanthin trong hạt chuyển gen.
    • 3.11.2.7. Đánh giá các giai đoạn sinh trưởng cây chuyển gen To, T1 trong điều kiện ex vitro

• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

  • KẾT LUẬN

  • KIẾN NGHỊ

  • NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN