NGHIÊN CỨU TẠO BA KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG (AFP, DCP, TXN) VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG PHÁT HIỆN UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN
Công nghệ sinh học
Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) là một thách thức y tế toàn cầu, với chỉ thị sinh học truyền thống như Alpha-fetoprotein (AFP) còn hạn chế về độ nhạy. Luận án này tập trung vào việc nghiên cứu tạo ba kháng thể đơn dòng đặc hiệu (AFP, DCP, Thioredoxin - TXN) và bước đầu ứng dụng chúng trong phát hiện HCC, nhằm cải thiện độ chính xác và tin cậy của chẩn đoán. Nghiên cứu đã thành công trong việc tạo ra ba kháng nguyên tái tổ hợp của AFP (15 kDa), DCP (10 kDa) và TXN (12 kDa) với tính kháng nguyên cao, độ tinh khiết trên 80%, phù hợp cho các bước phát triển tiếp theo, đánh dấu lần đầu tiên tại Việt Nam tạo được các kháng nguyên này.
Từ các kháng nguyên tái tổ hợp, sáu dòng tế bào lai hybridoma (AFP1, AFP2, DCP1, DCP2, TXN1, TXN2) đã được tạo thành, có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng IgG đặc hiệu với hiệu giá cao (11-14 ml dịch báng/chuột) và độ tinh khiết >95%. Các kháng thể này đã được tinh sạch và xác nhận cấu trúc chuỗi nặng, nhẹ đặc trưng của IgG. Ứng dụng các kháng thể đơn dòng tự tạo trong xét nghiệm ELISA gián tiếp trên mẫu huyết thanh bệnh nhân đã cho thấy hiệu quả. Độ nhạy của từng chỉ thị lần lượt là: AFP 89.36%, DCP 91.48%, TXN 95.74%; độ đặc hiệu là: AFP 68.00%, DCP 80.00%, TXN 84.00%. Đặc biệt, khi phối hợp từ 2/3 chỉ thị sinh học trở lên, độ nhạy đạt 97.87% và độ đặc hiệu 92.00%, với giá trị dự đoán dương tính (PPV) và dự đoán âm tính (NPV) đều đạt 95.83%, cho thấy hiệu suất chẩn đoán vượt trội so với từng marker đơn lẻ, đặc biệt trong các trường hợp AFP âm tính. Kết quả này khẳng định giá trị của xét nghiệm ELISA đa marker trong sàng lọc HCC giai đoạn sớm và góp phần nội địa hóa sinh phẩm chẩn đoán ung thư gan tại Việt Nam.
Mặc dù đạt được những kết quả quan trọng, nghiên cứu còn hạn chế về quy mô mẫu thử nghiệm (47 bệnh nhân HCC, 10 nhóm gan lành tính) và quy trình ELISA ban đầu còn thủ công, chưa được đánh giá độ ổn định và lặp lại ở quy mô lớn. Do đó, luận án kiến nghị tiếp tục đánh giá giá trị lâm sàng ở quy mô lớn, đa trung tâm, và hoàn thiện quy trình chuẩn hóa kỹ thuật ELISA để tiến tới phát triển bộ kit thương mại.
1.1.1. Dịch tễ học của bệnh ung thư biểu mô tế bào gan
1.1.2. Các yếu tố liên quan đến cơ chế bệnh sinh của HCC
1.2.1. Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh
1.2.2. Phương pháp chẩn đoán mô bệnh học, tế bào học và sinh thiết lỏng
1.2.3. Xét nghiệm các chỉ thị sinh học đặc hiệu ung thư biểu mô tế bào gan
1.2.3.1. Alpha-fetoprotein (AFP)
1.2.3.2. DCP (des-gamma-carboxy prothrombin)
1.2.3.3. TXN (Thioredoxin)
1.2.3.4. Ưu điểm của ba marker AFP, DCP, TXN trong chẩn đoán HCC
1.3.1. Khái niệm và một số nghiên cứu kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán ung thư
1.3.2. Các phương pháp tạo kháng thể đơn dòng
1.3.2.1. Phương pháp tạo tế bào lai hybridoma
1.3.2.2. Công nghệ tái tổ hợp kháng thể và các công nghệ phát triển kháng thể đơn dòng mới
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu của mục tiêu tạo kháng nguyên tái tổ hợp ba chỉ thị sinh học AFP, DCP, và TXN
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu của mục tiêu tạo kháng thể đơn dòng từ các kháng nguyên tái tổ hợp đã được tạo thành
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu bước đầu ứng dụng các kháng thể đơn dòng tạo thành để phát hiện sớm ung thư biểu mô tế bào gan
2.3.1. Nghiên cứu in silico nhằm tìm kiếm các đoạn gen giàu eptiope
2.3.2. Phương pháp tạo kháng nguyên tái tổ hợp
2.3.3. Phương pháp tạo kháng thể đơn dòng
2.3.4. Tinh sạch kháng thể đơn dòng
2.3.5. Sử dụng kháng thể đơn dòng trong phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên trong các mẫu huyết thanh bệnh nhân
3.1.1. Kết quả dự đoán epitope của các protein AFP, DCP, TXN
3.1.1.1. Dự đoán epitope liên tục
3.1.1.2. Dự đoán epitope không liên tục
3.1.1.3. Kết quả lựa chọn đoạn peptide giàu epitope
3.1.1.4. Đánh giá tính kháng nguyên của các đoạn protein lựa chọn
3.1.1.5. Đánh giá tính chất vật lý của ba đoạn protein
3.1.1.6. Thiết kế và tối ưu hóa trình tự nucleotide cho biểu hiện tái tổ hợp
3.1.2. Kết quả biến nạp vào E.coli
3.1.3. Giải trình tự DNA của AFP/DCP/TXN
3.1.4. Biểu hiện protein tái tổ hợp
3.1.4.1. Kết quả biểu hiện protein tổng số
3.1.4.2. Tối ưu biểu hiện AFP, DCP, TXN
3.1.5. Tinh sạch các protein tái tổ hợp
3.1.6. Kiểm tra sản phẩm tinh sạch bằng phản ứng Western blot
3.1.7. Đo nồng độ protein tái tổ hợp
3.2.1. Kết quả gây kích ứng miễn dịch trên chuột BALB/c
3.2.2. Kết quả dung hợp tế bào lympho B của chuột và tế bào myeloma
3.2.2.1. Kết quả phục hồi, cấy chuyển và nhân giống tế bào myeloma
3.2.2.2. Kết quả dung hợp tế bào myeloma và tế bào lympho B
3.2.3. Kết quả sàng lọc và tách dòng các tế bào lai có khả năng sinh kháng thể đơn dòng
3.2.4. Kết quả gây báng thu dịch kháng thể bằng các dòng tế bào lai
3.2.4.1. Kết quả gây báng cho chuột BALB/c bằng AFP1 và AFP2
3.2.4.2. Kết quả gây báng cho chuột BALB/c bằng DCP1 và DCP2
3.2.4.3. Kết quả gây báng cho chuột BALB/c bằng TXN1 và TXN2
3.2.4.4. Đánh giá kết quả gây báng cho chuột BALB/c bằng 6 dòng tế bào lai
3.2.5. Kết quả đánh giá hiệu giá kháng thể trong dịch báng chuột
3.2.5.1. Đối với hai dòng tế bào lai AFP1 và AFP2
3.2.5.2. Đối với hai dòng tế bào lai DCP1 và DCP2
3.2.5.3. Đối với hai dòng tế bào lai TXN1 và TXN2
3.2.5.4. Đánh giá hiệu giá kháng thể trong dịch báng chuột với 6 dòng tế bào lai
3.2.6. Kết quả tinh sạch kháng thể đơn dòng
3.3.1. Đặc điểm chung của các nhóm nghiên cứu
3.3.1.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan
3.3.1.2. Đặc điểm chung của các nhóm không mắc ung thư biểu mô tế bào gan
3.3.1.3. Các chỉ số sinh hóa đánh giá chức năng gan trong các nhóm nghiên cứu
3.3.2. Kết quả phản ứng ELISA của các nhóm nghiên cứu
3.3.2.1. Tối ưu các điều kiện phản ứng ELISA gián tiếp phát hiện kháng nguyên AFP/DCP/TXN trong mẫu huyết thanh bệnh nhân
3.3.2.2. Xây dựng và đánh giá đường cong chuẩn 4 tham số
3.3.2.3. Kết quả phân tích các mẫu bệnh với đường cut-off
3.3.2.4. So sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp ELISA gián tiếp với chẩn đoán xác định theo hồ sơ bệnh án
3.3.2.5. So sánh với kháng thể thương mại tương ứng
3.3.2.6. Kết quả dựng biểu đồ ROC