NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ĐỘC TỐ DIỆT SÂU ĐỤC QUẢ ĐẬU TƯƠNG (Etiella zinckenella Treitschke) TỪ VI KHUẨN Bacillus thuringiensis BẢN ĐỊA.
Công nghệ sinh học
Luận án này tập trung vào nghiên cứu phát triển các giải pháp sinh học để kiểm soát sâu đục quả đậu tương (Etiella zinckenella Treitschke), một loài côn trùng gây hại nghiêm trọng cho cây đậu tương (Glycine max) ở Việt Nam. Xuất phát từ thực trạng phụ thuộc lớn vào đậu tương nhập khẩu và thách thức phòng trừ sâu bệnh, nghiên cứu đặt mục tiêu sàng lọc, phân lập gen mới mã hóa protein độc tố diệt côn trùng từ các chủng Bacillus thuringiensis (Bt) bản địa và biểu hiện protein độc tố Bt mới có khả năng diệt hiệu quả sâu đục quả đậu tương.
Nghiên cứu đã tiến hành sàng lọc 221 chủng Bt bản địa từ bộ sưu tập của Viện Công nghệ sinh học, xác định được 4 chủng (SP14.2, Đ6.1, Đ6.2, BD8.2) có hoạt tính diệt sâu trên 85%. Hệ gen của 4 chủng này đã được giải trình tự bằng công nghệ SMRT sequencing, với kích thước dao động từ 6,8 – 7,1 Mb và độ hoàn thiện cao (90,1 - 92,9%). Từ dữ liệu này, 4 gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng mới tiềm năng (hạng 4) đã được tìm thấy, bao gồm cry1Na, cry1Be, cry2Ab và cry2Ah.
Các gen cry1Be, cry1Na, cry2Ab và cry2Ah đã được phân lập, nhân dòng và biểu hiện thành công trong tế bào E. coli BL21. Trong số đó, protein Cry2Ab tái tổ hợp cho thấy hoạt lực diệt sâu đục quả đậu tương Etiella zinckenella mạnh nhất, đạt 96,67%. Protein Cry2Ab39 tái tổ hợp (một loại Cry2Ab mới đã được cấp bằng sáng chế số 37733 và công bố trên GenBank với mã MN319700.1 và QIQ19560.1) đã được tối ưu hóa điều kiện biểu hiện trong E. coli BL21 ở dạng protein tan và tinh sạch. Giá trị liều gây chết trung bình (LC50) của protein Cry2Ab39 đối với ấu trùng sâu non tuổi 2 E. zinckenella được xác định là 1,74 µg protein/g thức ăn.
Ngoài ra, gen cry2Ab39 đã được cải biến mã di truyền (cry2Ab39opt) để phù hợp với hệ thống biểu hiện ở thực vật. Quy trình biểu hiện tạm thời protein Cry2Ab39 trong lá thuốc lá N. benthamiana bằng phương pháp agroinfiltration đã được xây dựng và tối ưu, bao gồm việc lựa chọn promoter rbcS1A hiệu quả, mật độ vi khuẩn xâm nhiễm (OD600 = 0,5) và thời gian thu hoạch lá (6 ngày sau biến nạp).
1. Tính cấp thiết của luận án
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
1.1. Đậu tương và côn trùng gây hại
1.2. Protein độc tố diệt côn trùng có nguồn gốc từ Bacillus thuringiensis
1.3. Một số thành tựu về tạo cây đậu tương chuyển gen kháng sâu
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả sàng lọc chủng Bt có hoạt lực diệt sâu đục quả đậu tương cao từ các chủng trong bộ sưu tập Bt bản địa của Việt Nam
3.2. Phân tích, xác định các gen độc tố Bt mới tiềm năng từ cơ sở dữ liệu trình tự hệ gen của 4 chủng Bt có độc lực cao với sâu đục quả đậu tương
3.3. Kết quả phân lập, tách dòng và xác định trình tự các gen cry mã hóa protein độc tố mới có tiềm năng diệt sâu đục quả đậu tương từ các chủng Bt lựa chọn.
3.4. Kết quả thiết kế vector, biểu hiện các gen độc tố cry của các chủng Bt trong tế bào E. coli và đánh giá hoạt tính diệt sâu đục quả đậu tương của protein tái tổ hợp
3.5. Tối ưu mã gen cry2Ab39 để phù hợp với hệ thống biểu hiện ở thực vật và biểu hiện tạm thời protein độc tố Cry2Ab39 trong lá thuốc lá N. benthanmiana bằng phương pháp Agroinfiltration.