Luận án KHAI THÁC DỮ LIỆU DNA ĐA HỆ GEN, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA β-XYLOSIDASE TỪ VI SINH VẬT RUỘT MỐI Coptotermes gestroi Ở VIỆT NAM

Tên luận án:

KHAI THÁC DỮ LIỆU DNA ĐA HỆ GEN, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ẞ-XYLOSIDASE TỪ VI SINH VẬT RUỘT MỐI Coptotermes gestroi Ở VIỆT NAM

Ngành:

DI TRUYỀN HỌC

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Luận án "Khai thác dữ liệu DNA đa hệ gen, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của β-xylosidase từ vi sinh vật ruột mối Coptotermes gestroi ở Việt Nam" tập trung vào việc giải quyết thách thức trong khai thác enzyme phân hủy lignocellulose từ vi sinh vật ruột mối. Lignocellulose là nguồn sinh khối thực vật dồi dào nhưng việc xử lý truyền thống còn nhiều hạn chế, trong khi phương pháp enzyme thân thiện môi trường hơn. Mối C. gestroi là loài có khả năng tiêu hóa lignocellulose hiệu quả nhờ hệ vi sinh vật đường ruột. Tuy nhiên, việc khai thác enzyme từ các vi sinh vật này bị hạn chế do khó nuôi cấy. Kỹ thuật Metagenomics đã cung cấp lượng lớn dữ liệu DNA đa hệ gen, nhưng việc tìm kiếm gen đích vẫn mất nhiều thời gian và hiệu quả biểu hiện chưa cao.

Mục tiêu của luận án là nghiên cứu sự đa dạng của hệ vi khuẩn và enzyme thủy phân lignocellulose trong ruột mối C. gestroi từ dữ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen. Đồng thời, luận án xây dựng một phương pháp hiệu quả để tìm kiếm nhanh gen đích mã hóa lignocellulase có hoạt tính đúng. Cụ thể, nghiên cứu biểu hiện gen Xbx14 và tính chất của enzyme β-xylosidase.

Nghiên cứu đã khai thác 20 loài vi khuẩn có số lượng ORF lớn trong ruột mối C. gestroi, trong đó 3 loài tham gia chuyển hóa nitơ và 5 loài tham gia thủy phân lignocellulose độc đáo. Luận án cũng xác định được 52 họ lignocellulase theo phân loại CAZY. Đặc biệt, luận án đã xây dựng thành công phương pháp tìm kiếm gen dựa trên trình tự axit amin bảo thủ, sử dụng mẫu dò từ họ GH43 để xác định gen GL0112518 (được đặt tên là Xbx14). Gen Xbx14 đã được biểu hiện thành công và nghiên cứu tính chất, cho thấy đây là enzyme β-xylosidase mới với hoạt tính tốt, tối ưu ở nhiệt độ cao (60°C) và pH kiềm (pH 9), có độ bền nhiệt đáng kể (20-60°C). Các thông số động học của Xbx14 là Km = 3,18 mM, Vmax = 6,5 µmol/phút và hoạt tính riêng 24,54 U/mg. Enzyme Xbx14 hứa hẹn tiềm năng ứng dụng cao trong công nghiệp.

Mục lục chi tiết:

• MỞ ĐẦU

  • 1. Lý do chọn đề tài
  • 2. Mục tiêu
  • 2.1. Mục tiêu chung
  • 2.2. Mục tiêu cụ thể
  • 3. Nội dung nghiên cứu
  • 4. Đối tượng
  • 5. Phạm vi nghiên cứu
  • 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
  • 6.1. Ý nghĩa khoa học
  • 6.2. Ý nghĩa thực tiễn
  • 7. Đóng góp mới của luận án
  • 8. Nơi thực hiện đề tài luận án

• Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

  • 1.1. LIGNOCELLULOSE VÀ QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA
  • 1.1.1. Lignocellulose: Trình bày vai trò và thành phần cấu tạo của lignocellulose
  • 1.1.2. Sự chuyển hóa lignocellulose: Mô tả hệ thống enzyme tham gia chuyển hóa lignocellulose
  • 1.2. METAGENOMICS VÀ CÔNG CỤ TIN SINH HỌC KHAI THÁC DỮ LIỆU DNA ĐA HỆ GEN
  • 1.2.1. Metagenomics: Trình bày khái niệm chung về Metagenomics, cách tiếp cận trong nghiên cứu và ứng dụng.
  • 1.2.2. Một số công cụ tin sinh sử dụng để phân tích số liệu
  • 1.2.3. Các nguồn dữ liệu: Mô tả chi tiết bao gồm nguồn gốc, lượng dữ liệu, cập nhật dữ liệu và độ tin cậy của hai nguồn dữ liệu sử dụng trong nghiên cứu gồm CAZY và NCBI.
  • 1.2.4. Mẫu dò DNA và ứng dụng
  • 1.3. ENZYME β-xylosidase
  • 1.4. KHU HỆ VI SINH VẬT VÀ ENZYME CHUYỂN HÓA LIGNOCELLULOSE
  • 1.4.1. Một số khu hệ vi sinh vật chuyển hóa lignocellulose
  • 1.4.2. Hệ vi sinh vật và enzyme thủy phân lignocellulose trong ruột mối
  • 1.4.3. Tổng quan nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật và enzyme chuyển hóa lignocellulose trong ruột mối C. gestroi ở Việt Nam

• Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

  • 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU
  • 2.1.1. Đối tượng
  • 2.1.2. Hóa chất và thiết bị máy móc
  • 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
  • 2.2.1. Phương pháp xây dựng mẫu dò
  • 2.2.2. Các phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm tin sinh học
  • 2.2.3. Các phương pháp vi sinh: Giữ chủng E. coli; cấy ria tạo khuẩn lạc đơn; nuôi cấy vi khuẩn.
  • 2.2.4. Các phương pháp sinh học phân tử: Giải trình tự DNA bằng máy giải trình tự thế hệ mới HiSeq2000 của Illumina, biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E. coli bằng sốc nhiệt, tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E.coli, cắt kiểm tra gen, điện di DNA trên gel agarose, đồng biểu hiện gen.
  • 2.2.5. Các phương pháp hóa sinh protein: Phương pháp điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide – SDS, tinh chế protein bằng tủa phân đoạn, định lượng axit nucleic/protein bằng phương pháp đo mật độ quang, phương pháp xác định hoạt tính β–xylosidase, xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và pH, xác định độ bền của enzyme, phương pháp xác định thông số động học của enzyme.

• Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

  • 3.1. NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN VÀ LIGNOCELLULASE THEO HỆ THỐNG PHÂN LOẠI CỦA CAZY TỪ DỮ LIỆU DNA ĐA HỆ GEN CỦA VI SINH VẬT TRONG RUỘT MỐI C. gestroi
  • 3.1.1. Nghiên cứu đa dạng hệ vi khuẩn sống trong ruột mối C. gestroi
  • 3.1.1.1. Thành phần các loài vi khuẩn có số lượng ORF lớn trong ruột mối C. gestroi
  • 3.1.1.2. Đặc điểm các loài vi khuẩn giúp C. gestroi chuyển hóa Nitơ
  • 3.1.1.3. Đặc điểm các loài vi khuẩn giúp C. gestroi chuyển hóa lignocellulose
  • 3.1.2. Nghiên cứu đa dạng lignocellulase của vi sinh vật sống trong ruột mối C. gestroi
  • 3.1.2.1. Đa dạng ORF mã hóa lignocellulase theo phân loại của CAZY
  • 3.1.2.2. Đa dạng ORF mã hóa β-xylosidase theo phân loại của CAZY
  • 3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÌM KIẾM GEN MÃ HÓA β–XYLOSIDASE TỪ DỮ LIỆU DNA ĐA HỆ GEN CỦA VI SINH VẬT TRONG RUỘT MỐI C. gestroi
  • 3.2.1. Xác định các họ GH chứa β-xylosidase theo CAZY
  • 3.2.2. Tìm kiếm các trình tự axit amin của β–xylosidase đã được nghiên cứu thực nghiệm
  • 3.2.3. Nhóm các trình tự đã tìm kiếm được để xác định vùng tương đồng bằng ClustalW – PBIL
  • 3.2.4. Xây dựng mẫu dò và giá trị tham chiếu
  • 3.2.5. Khai thác trình tự gen mã hóa β–xylosidase bằng mẫu dò từ số liệu DNA đa hệ gen của vi sinh vật trong ruột mối C. gestroi
  • 3.2.6. Khảo sát cấu trúc bậc 3 của các trình tự β–xylosidase đã khai thác bằng mẫu dò
  • 3.2.7. Dự đoán cấu trúc và chức năng của các gen mã hóa β-xylosidase bằng một số công cụ tin sinh học
  • 3.2.8. Một số dự đoán chi tiết gen GL0112518 mã hóa β–xylosidase (Xbx14)
  • 3.2.8.1. Kết quả dự đoán chức năng của Xbx14 bằng BLASTP
  • 3.2.8.2. Kết quả dự đoán cấu trúc không gian của Xbx14 bằng PHYRE 2
  • 3.2.8.3. Kiểm tra nguồn gốc của mã gen GL0112518 bằng công cụ Blast -Explorer
  • 3.3. BIỂU HIỆN GEN Xbx14 VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA β-XYLOSIDASE
  • 3.3.1. Biểu hiện gen Xbx14
  • 3.3.1.1. Kiểm tra gen Xbx14 trong vector pET22b(+)
  • 3.3.1.2. Đồng biểu hiện gen mã hóa Xbx14 và chaperone trong E. coli Rosetta 1
  • 3.3.1.3. Tối ưu điều kiện biểu hiện gen Xbx14
  • a. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện gen Xbx14 trong tế bào E. coli Rosetta 1
  • b. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến hiệu quả cảm ứng
  • c. Ảnh hưởng của thời điểm cảm ứng đến hiệu quả biểu hiện protein Xbx14
  • d. Ảnh hưởng thời gian thu mẫu đến hiệu quả biểu hiện Xbx14
  • 3.3.2. Tinh chế Xbx14
  • 3.3.2.1. Tinh chế Xbx14 bằng muối (NH4)2SO4
  • 3.3.2.2. Kiểm tra độ sạch của Xbx14 sau tinh chế bằng phần mềm Quantity one
  • 3.3.3. Nghiên cứu tính chất của Xbx14
  • 3.3.3.1. Xác định hoạt tính của Xbx14
  • 3.3.3.2. Xác định tính đặc hiệu cơ chất của Xbx14
  • 3.3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của Xbx14
  • 3.3.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của Xbx14
  • 3.3.3.5. Nghiên cứu độ bền nhiệt của Xbx14
  • 3.3.3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số ion kim loại và hóa chất lên hoạt tính của Xbx14
  • 3.3.3.7. Nghiên cứu đặc điểm động học của Xbx14

• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

  • Kết luận
  • Kiến nghị

• CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ