Tên luận án:
NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT PHÁT HIỆN CHỦNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI O157:H7 VÀ TẠO KHÁNG THỂ TỔ HỢP ĐẶC HIỆU
Ngành:
Di truyền học (Mã số: 62.42.01.21)
Tóm tắt nội dung tài liệu:
Luận án tập trung vào nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu, nhằm giải quyết vấn đề ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng do vi khuẩn này gây ra. E. coli O157:H7 là một chủng độc hại phổ biến, đã được xác định ở Việt Nam từ năm 2005 và liên quan đến nhiều vụ ngộ độc thực phẩm. Mục tiêu chính của nghiên cứu là phát triển các kỹ thuật chẩn đoán E. coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu. Các nội dung nghiên cứu bao gồm việc xác định chủng E. coli O157:H7 bằng các kỹ thuật di truyền như tách dòng và xác định trình tự gen 16S rRNA, gen độc tố Stx1 và Stx2, cùng với kỹ thuật LAMP. Đồng thời, nghiên cứu cũng tập trung vào việc tạo dòng gen mã hóa kháng thể đặc hiệu bằng kỹ thuật phage display, thu nhận và xác định độ nhạy, tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp.
Những điểm mới của đề tài là việc tạo được kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu E. coli O157:H7 bằng kỹ thuật phage display và bước đầu sử dụng phức hợp nano-kháng thể để phát hiện vi khuẩn này bằng phương pháp soi dưới kính hiển vi. Kết quả nghiên cứu đã thành công trong việc tách dòng và xác định trình tự gen 16S rRNA (1,5kb) và hai gen độc tố Stx1 (151bp), Stx2 (205bp) từ E. coli O157:H7 tại Việt Nam, với độ tương đồng cao so với các chủng đã công bố. Phản ứng LAMP trên gen Stx2 đã được ứng dụng hiệu quả để phát hiện E. coli O157:H7 với nồng độ DNA 93,5pg/µl trong 25 phút. Đặc biệt, luận án đã thu nhận được dòng phage mang đoạn gen mã hóa kháng thể scFv có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với E. coli O157:H7. Kháng thể tái tổ hợp này đã được biểu hiện thành công trên vector pET28a-TRX với trọng lượng phân tử khoảng 30,8 kDa và được kiểm tra tính đặc hiệu bằng các phương pháp Western Blot, Dot blot và ELISA.
Các kết quả này có ý nghĩa khoa học trong việc đánh giá các phương pháp phát hiện và cung cấp dẫn liệu về ứng dụng phage display, cũng như ý nghĩa thực tiễn to lớn trong việc phát triển kit phát hiện nhanh E. coli O157:H7 đơn giản, hiệu quả và giá thành thấp, phù hợp với điều kiện Việt Nam. Đề tài cũng kiến nghị tiếp tục nghiên cứu ứng dụng phức hợp nano-kháng thể và tạo kit xác định E. coli O157:H7 trong thực phẩm.
Mục lục chi tiết:
- Mở đầu
- Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
- Đặc điểm vi khuẩn E. coli O157:H7
- Đặc điểm chung của chủng vi khuẩn E. coli O157:H7
- Độc tố Shiga-like toxin bản chất và tác hại
- Nguyên nhân và diễn biến khi ngộ độc
- Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn ở Việt Nam
- Các phương pháp phát hiện và xác định vi khuẩn E. coli O157:H7
- Phương pháp PCR dựa trên DNA
- Kỹ thuật LAMP
- Sử dụng kháng thể tái tổ hợp trong phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7
- Phát triển kit xác định nhanh vi khuẩn E. coli O157:H7
- Kháng thể
- Mảnh kháng thể
- Kháng thể tái tổ hợp
- Kỹ thuật phage display
- Tình hình nghiên cứu sử dụng kháng thể ở Việt Nam
- Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- 2.1. Vật liệu nghiên cứu
- 2.2. Thiết bị
- 2.3. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp nghiên cứu DNA
- Kỹ thuật bộc lộ trên thực khuẩn thể (phage display)
- Phương pháp nghiên cứu protein
- Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
- Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
- 3.1. XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E. COLI O157:H7 BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DNA
- 3.1.1. Xác định chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng kỹ thuật PCR gen mã hóa 16S rRNA
- 3.1.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ tế bào vi khuẩn
- 3.1.1.2. Nhân bản đoạn gen mã hoá 16S rRNA
- 3.1.1.3. Biến nạp plasmid tái tổ hợp mang gen 16S rRNA vào tế bào E. coli DH5a
- 3.1.1.4. Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA
- 3.1.2. Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen Stx1 và Stx2 của vi khuẩn E. coli O157:H7
- 3.1.2.1. Nhân bản đoạn gen Stx1 và Stx2
- 3.1.2.2. Chọn dòng gen Stx1 và Stx2 trong vector pJET1.2/blunt
- 3.1.2.3. Xác định trình tự đoạn gen Stx1 và Stx2
- 3.1.3. Sử dụng kỹ thuật LAMP xác định vi khuẩn E. coli O157:H7
- 3.1.3.1. Mồi và thiết kế mồi
- 3.1.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ tế bào vi khuẩn
- 3.1.1.2. Phản ứng LAMP
- 3.1.1.3. Phát hiện sản phẩm LAMP
- 3.2. NGHIÊN CỨU THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỐI VỚI VI KHUẨN E. COLI O157:H7
- 3.2.1. Sàng lọc kháng thể từ thư viện Griffin.1
- 3.2.2. Chọn dòng kháng thể phage đặc hiệu với vi khuẩn E. coli O157: H7
- 3.2.3. Nhân bản gen mã hóa kháng thể bằng PCR
- 3.2.4. Giải trình tự gen mã hoá kháng thể
- 3.3. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP
- 3.3.1. Tạo dòng gen mã hoá kháng thể tái tổ hợp
- 3.3.2. Thiết kế vector pET28a TRX mang gen mã hoá kháng thể
- 3.3.3. Biểu hiện gen kháng thể tái tổ hợp
- 3.3.4. Tối ưu hoá điều kiện biểu hiện gen mã hoá kháng thể
- 3.4. TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP
- 3.4.1. Kiểm tra độ hoà tan và tinh sạch kháng thể tái tổ hợp
- 3.4.2. Xác định tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp bằng các phương pháp lai blot
- 3.4.3. Kiểm tra hoạt tính kháng thể bằng ELISA
- 3.4.4. Xác định tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp bằng gắn nano
- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ