NGHIÊN CỨU THU NHẬN POLYSACCHARIDE NGOẠI BÀO CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ NẤM Cordyceps sinensis
CÔNG NGHỆ SINH HỌC (Mã số: 9 42 02 01)
Luận án tập trung nghiên cứu thu nhận polysaccharide ngoại bào (EPS) có hoạt tính sinh học từ nấm Cordyceps sinensis nuôi cấy lỏng-tĩnh nhằm tối ưu quy trình công nghệ sản xuất nấm dược liệu này tại Việt Nam. Mục tiêu chính là xây dựng quy trình thu nhận EPS có hoạt tính sinh học. Các nội dung nghiên cứu bao gồm khảo sát nguồn nitơ thích hợp, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy bằng cách bổ sung dầu thực vật, khảo sát thu nhận, tinh sạch và cải biến sulfate hóa nhằm nâng cao hoạt tính sinh học của các phân đoạn EPS, cũng như xác định thành phần cấu tạo và cấu trúc hóa học của EPS.
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng peptone và cao nấm men là nguồn nitơ thích hợp trong nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm C. sinensis để thu nhận EPS có hoạt tính kháng oxy hóa tốt hơn so với bột nhộng tằm. Việc bổ sung dầu ô liu 5% vào môi trường nuôi cấy cơ bản đã kích thích tăng sinh tổng hợp EPS bởi nấm C. sinensis nuôi cấy lỏng-tĩnh. Quá trình tinh sạch EPS được thực hiện bằng phương pháp loại protein sử dụng Alcalase, sau đó thu nhận các phân đoạn EPS (EPS I và EPS II) thông qua sắc ký lọc gel và thu nhận phân đoạn EPS 100-750 kDa bằng lọc tiếp tuyến.
Một đóng góp mới của luận án là cải biến nâng cấp hoạt tính sinh học của phân đoạn EPS 100-750 kDa bằng sulfate hóa, giúp cải thiện đáng kể hoạt tính kháng oxy hóa in vitro và ức chế tyrosinase. Quy trình tạo dẫn xuất sulfate-EPS bằng phương pháp EPS/SO3.Py với tỷ lệ 1:5, 90 °C, 2h đã đạt DS = 2,32 và hiệu suất 90,375%, cao hơn các nghiên cứu công bố trước đây. Luận án cũng xác định được ba đơn vị đường đơn chính trong mạch EPS là glucose, mannose, galactose, với mạch chính là →3)-β-D-Manp-(1→ và hai mạch nhánh 2,3)-α-D-Manp và α-D-Manp-(2,3,6. Cấu trúc EPS thay đổi phụ thuộc vào cá thể nấm và môi trường nuôi cấy. Phổ 1H NMR làm rõ vị trí các C anomeric của Manp, Galp và Glcp. Đây là nghiên cứu lần đầu tiên xây dựng quy trình thu nhận và tinh sạch EPS từ môi trường nuôi cấy C. sinensis tại Việt Nam, góp phần chủ động tạo nguồn EPS có hoạt tính sinh học.
1. Tính cấp thiết của luận án
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
1.1. Tổng quan về exopolysaccharide
1.2. Cải thiện hoạt tính sinh học của polysaccharide
1.3. Xác định các phân đoạn và phân tích thành phần EPS thu được
1.4. Xác định liên kết, cấu trúc exopolysaccharide
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát nguồn nitơ thích hợp trong nuôi cấy nấm C. sinensis để thu nhận EPS có hoạt tính sinh học
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh trong môi trường bổ sung dầu ô liu
2.2.3. Tách chiết EPS từ dịch nuôi cấy Cordyceps sinensis bổ sung dầu
2.2.3.1. Tách chiết exopolysaccharide từ dịch nuôi cấy Cordyceps sinensis bổ sung dầu ô liu
2.2.3.2. Khảo sát dung môi hữu cơ loại dầu ra khỏi dịch bằng kĩ thuật chiết lỏng-lỏng
2.2.3.3. Khảo sát tỷ lệ tủa ethanol 96° để thu nhận exopolysaccharide từ môi trường bổ sung dầu
2.2.3.4. Phương pháp loại protein
2.2.4. Thu nhận phân đoạn EPS
2.2.4.1. Thu nhận phân đoạn EPS bằng phương pháp lọc tiếp tuyến
2.2.4.2. Thu nhận phân đoạn EPS bằng sắc ký lọc gel
2.2.5. Cải biến sulfate hóa EPS
2.2.5.1. Tạo dẫn xuất EPS sulfate hóa
2.2.5.2. Phương pháp xác định độ thay thế (DS)
2.2.6. Phương pháp xác định thành phần monosaccharide của EPS
2.2.7. Phương pháp xác định và dự đoán cấu trúc - liên kết của EPS
2.2.8. Phương pháp xác định cấu trúc tổng thể của EPS
2.2.9. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học của EPS
2.2.9.1. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của EPS bằng khả năng bắt gốc tự do ABTS⁺
2.2.9.2. Phương pháp xác định khả năng kháng phân bào
2.2.9.3. Phương pháp khảo sát soạt tính ức chế Tyrosinase
2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu
3.1. Khảo sát điều kiện nuôi cấy lỏng-tĩnh C. sinensis
3.1.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến tạo sinh khối và phức EPS
3.1.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến thành phần EPS trong phức EPS
3.1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của phức EPS
3.2. Khảo sát nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm C. sinensis kích thích tăng sinh tổng hợp và hoạt tính sinh học của EPS bằng dầu thực vật
3.2.1. Sự thay đổi hàm lượng sinh khối và EPS của nấm C. sinensis trong môi trường nuôi cấy có bổ sung dầu thực vật
3.2.2 Khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do ABTS của tủa phức protein-EPS thu được từ 3 môi trường bổ sung dầu
3.2.3 Khảo sát thời gian thích hợp thu nhận sinh khối và EPS trong dịch nuôi cấy bổ sung dầu ô liu
3.3 Tối ưu hoá khả năng tổng hợp EPS trong môi trường bổ sung dầu ô liu
3.3 Xây dựng quy trình tách chiết EPS từ môi trường bổ sung dầu ô liu
3.3.1 Kết quả xác định dung môi loại dầu
3.3.2 Khảo sát hàm lượng polysaccharide và lipid trong dịch nuôi cấy nấm sau khi loại dầu
3.3.3 Khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do ABTS⁺ của các mẫu loại dầu
3.3.4 Khảo sát thu nhận phức EPS-protein
3.5. Thu nhận, tinh sạch và cải biến sulfate hóa nâng cao hoạt tính sinh học của các phân đoạn EPS
3.5.1. Thu nhận và tinh sạch EPS
3.5.2. Thu nhận và khảo sát hoạt tính sinh học của các phân đoạn EPS
3.5.2.1. Thu nhận các phân đoạn EPS bằng lọc gel
3.5.2.2. Thu nhận phân đoạn EPS lọc gel sau khi loại bỏ protein bằng Alcalase 20 UI/ml
3.5.2.4. Khảo sát hoạt tính kháng phân bào của phân đoạn EPS I và EPS II
3.5.3. Khảo sát thu nhận và tinh sạch phân đoạn EPS từ dịch nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm C. sinensis bằng lọc tiếp tuyến
3.5.4. Kết quả sulfate hóa của các phân đoạn EPS sau lọc trực tuyến
3.5.4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do ABTS+ của 3 phân đoạn EPS sau khi được sulfate hóa
3.5.4.2. Khảo sát hoạt tính kháng Tyrosinase của 3 phân đoạn EPS sau khi được nâng cấp sulfate hóa
3.6. Xác định thành phần cấu tạo và cấu trúc hóa học của EPS từ dịch nuôi nấm C. sinensis
3.6.1. Khảo sát đơn vị thành phần đường đơn của EPS
3.6.2. Xác định các dạng liên kết glycoside trong EPS
3.7. Bàn luận kết quả nghiên cứu của luận án và đề xuất quy trình nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm C. sinensis tạo EPS có hoạt tính sinh học
Kết luận:
Kiến nghị