Luận án Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. đối kháng với Vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp

Tên luận án:

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillius sp. ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio Parahaemolyticus TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP

Ngành:

Nuôi trồng thủy sản

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Luận án tập trung giải quyết vấn đề cấp bách về Hội chứng Hoại tử gan tụy cấp (AHPND) trong nuôi tôm công nghiệp, một dịch bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng từ năm 2010, đặc biệt tại Đồng bằng sông Cửu Long. Tác nhân chính gây AHPND đã được xác định là các chủng Vibrio parahaemolyticus có khả năng tiết độc tố nhị thể PirA/PirB. Nghiên cứu này hướng đến việc tìm kiếm các giải pháp sinh học bền vững thông qua ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. làm tác nhân đối kháng.

Các mục tiêu chính của đề tài bao gồm phân lập, lựa chọn và đánh giá các chủng Bacillus sp. có khả năng đối kháng với V. parahaemolyticus gây AHPND, cùng với việc đánh giá đa dạng di truyền của nhóm Bacillus sp. trong ao nuôi tôm thâm canh. Phương pháp nghiên cứu bao gồm phân lập V. parahaemolyticus và Bacillus sp. từ ao nuôi tôm, khảo sát gen độc lực, ảnh hưởng của yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến sự phát triển của vi khuẩn, đánh giá khả năng sinh enzyme thủy phân và xác định gen mã hóa bacteriocin.

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v mang gen pirA/pirB và toxR có khả năng gây chết 100% tôm thẻ chân trắng (TTCT) sau 36 giờ cảm nhiễm, với giá trị LD50 là 8008 cfu/mL sau 24 giờ. Luận án đã phân lập và xác định được hai chủng Bacillus có hoạt tính đối kháng mạnh mẽ là B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3. Các chủng này không chỉ có khả năng sinh enzyme mà còn phát triển tốt trong điều kiện môi trường rộng về nhiệt độ (26-40°C), pH (4.0-8.0) và độ mặn (0-40‰). Đặc biệt, chủng B. subtilis BRB2.1 mang gen sboA mã hóa subtilosin A, một bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng.

Các thử nghiệm trên mô hình nuôi tôm thẻ chân trắng ở quy mô 100 L và 1000 L chứng minh rằng việc bổ sung B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 giúp tăng đáng kể tỷ lệ sống của tôm (lần lượt 85,56% và 76,67% ở 100 L, và 87,83% đối với B. subtilis BRB2.1 ở 1000 L) và cải thiện hệ số chuyển đổi thức ăn. Phương pháp MLST đã được ứng dụng thành công, cho phép phân loại chính xác các loài Bacillus (B. subtilis, B. velezensis, B. siamensis, B. licheniformis) từ ao nuôi tôm, hiệu quả hơn so với giải trình tự 16S rDNA. Luận án đề xuất tiếp tục giải trình tự toàn bộ hệ gen của B. subtilis BRB2.1 và thử nghiệm chế phẩm sinh học trên quy mô lớn.

Mục lục chi tiết:

• CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

  • 1.1 Tình hình dịch AHPND trên Thế giới và Việt Nam
  • 1.2 Tác nhân gây AHPND trên tôm nuôi
  • 1.3 Chẩn đoán AHPND và biện pháp phòng chống
  • 1.4 Vi khuẩn Bacillus và ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản
  • 1.5 Phân loại Bacillus theo phương pháp phân tử

• CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

  • 2.1 Mẫu nghiên cứu
  • 2.2 Phương pháp nghiên cứu
  • 2.2.1 Phương pháp phân lập Bacillus và Vibrio parahaemolyticus
  • 2.2.2 Phương pháp phát hiện gen độc tố ở các chủng Vibrio sp. phân lập được
  • 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, độ mặn đến sự phát triển của V. parahaemolyticus
  • 2.2.4 Phương pháp tuyển chọn các chủng Bacillus sp.
  • 2.2.4.1 Tuyển chọn chủng Bacillus sp. có hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus
  • 2.2.4.2 Tuyển chọn chủng Bacillus sp. có hoạt tính protease cao
  • 2.2.4.3 Tuyển chọn chủng Bacillus sp. có hoạt tính amylase cao
  • 2.2.4.4 Tuyển chọn chủng Bacillus sp. có hoạt tính cellulase cao
  • 2.2.4.5 Tách chiết và tinh sạch DNA hệ gen của Bacillus
  • 2.2.5 Phương pháp phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng Bacillus BRB2.1
  • 2.2.5.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1
  • 2.2.5.2 PCR khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1
  • 2.2.5.3 Tách dòng và giải trình tự gen sboA từ Bacillus BRB 2.1
  • 2.2.5.4 Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide và trình tự axít amin của subtilosin A
  • 2.2.6 Đánh giá đa đạng di truyền của Bacillus sp. phân lập được dựa trên trình tự 16S rDNA
  • 2.2.7 Phương pháp đánh giá đa đạng di truyền của nhóm Bacillus dựa trên phân tích MLST
  • 2.2.8 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến sự phát triển của Bacillus sp.
  • 2.2.9 Nghiên cứu độc tính của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm
  • 2.2.10 Phương pháp thử nghiệm tính đối kháng của hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 với Vibrio sp. ở quy mô phòng thí nghiệm
  • 2.2.11 Khảo sát khả năng kháng V. parahaemolyticus của các chủng Bacillus sp. trong hệ thống bể nuôi tôm 100 lít
  • 2.2.12 Phương pháp khảo sát khả năng kháng Vibrio của các chủng Bacillus trong hệ thống bể nuôi tôm 1000 lít
  • 2.2.13 Phương pháp xử lý dữ liệu

• CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ

  • 3.1 Phân lập các chủng thuộc chi Vibrio trong ao nuôi tôm công nghiệp
  • 3.2 Kết quả phát hiện các gen độc lực ở các chủng Vibrio sp. phân lập được bằng PCR
  • 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, độ mặn đến sự phát triển của V. parahaemolyticus
  • 3.4 Kiểm tra khả năng gây AHPND của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên TTCT
  • 3.5 Nghiên cứu độc tính của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm
  • 3.6 Phân lập các chủng Bacillus trong ao tôm nông nghiệp
  • 3.7 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh học ứng dụng trong nuôi tôm công nghiệp
  • 3.8 Xác định sự có mặt của các gen mã hóa bacteriocin ở chủng BRB2.1
  • 3.8.1 Phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng BRB2.1
  • 3.8.2 Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu
  • 3.9 Đa dạng di truyền 30 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rDNA và phân tích MLST
  • 3.9.1. Phân tích đa dạng di truyền của 30 chủng vi khuẩn Bacillus bằng phương pháp giải trình tự 16S rDNA
  • 3.9.2. Phân tích đa dạng di truyền của 30 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus bằng MLST
  • 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, độ mặn đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3
  • 3.11 Nghiên cứu khả năng phòng chống AHPND của hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong hệ thống nuôi tôm thẻ chân trắng (TTCT) có dung tích 100 lít
  • 3.11.1 Nghiên cứu tính đối kháng của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đối với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND trong môi trường nước nuôi tôm
  • 3.11.2 Thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 Lít
  • 3.12 Nghiên cứu ảnh hưởng của chủng B. subtilis BRB2.1 đến tỷ lệ sống và sự phát triển của TTCT ở quy mô nuôi 1000 lít
  • 3.10.3 Tỉ lệ sống và sự phát triển của tôm trong quá trình thử nghiệm

• CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - ĐỀ XUẤT

  • 4.1 Kết luận
  • 4.2 Đề xuất