Luận án Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược

Tên luận án:

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP LÀM VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1 BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NGƯỢC

Ngành:

Di truyền học

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Luận án tập trung nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược. Bệnh cúm A/H5N1 là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm ở người và gia cầm, do virus HPAI H5N1 gây ra, có khả năng lây nhiễm hàng loạt và là mối đe dọa tiềm ẩn cho sức khỏe cộng đồng. Việt Nam hiện phụ thuộc vào các chủng virus gốc nhập ngoại để sản xuất vaccine, dẫn đến thiếu chủ động trong công tác phòng chống dịch bệnh. Đề tài đặt ra tính cấp thiết trong việc xây dựng và làm chủ quy trình ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược để chủ động tạo ra các chủng virus vaccine có hiệu quả bảo hộ cao với những chủng virus đang lưu hành trong nước, đặc biệt là clade 1.1 và 2.3.2.1c đã được xác định có tính tương đồng kháng nguyên và đặc tính di truyền phù hợp với yêu cầu của chủng dự tuyển vaccine.

Mục tiêu chính của luận án là tạo được chủng virus cúm tái tổ hợp làm giống gốc cho sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm gia cầm do virus độc lực cao A/H5N1 clade 1.1 và A/H5N1 clade 2.3.2.1c gây nên bằng ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược.

Nội dung nghiên cứu bao gồm các bước: phân lập cDNA của sáu phân đoạn gen khung (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) từ virus A/PR/8/34 và tách dòng riêng rẽ vào plasmid pHW2000; thiết kế và tách dòng hai gen H5 HA (đã được loại bỏ các amino acid kiềm ở vị trí vùng độc và tránh lại độc) và hai gen N1 NA của chủng A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) (clade 1.1) và A/duck/Viet Nam/HT-02/2014(H5N1) (clade 2.3.2.1c) vào plasmid pHW2000. Tiếp theo, tiến hành chuyển nhiễm hệ thống 6+2 plasmid đơn gen vào tế bào 293T để tái tạo hai loại virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c. Các chủng virus ứng viên vaccine này sau đó được phân lập và tuyển chọn dựa trên khả năng thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi với hiệu giá HA cao và tính ổn định di truyền. Cuối cùng, xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu (hiệu giá HI) của hai chủng virus ứng viên vaccine này trên gà sạch 3 ngày tuổi.

Luận án đã đóng góp mới quan trọng khi là công trình khoa học đầu tiên chứng minh Việt Nam đã làm chủ công nghệ di truyền ngược để tái tạo hiệu quả chủng virus ứng viên vaccine cúm A. Thành công này mở ra khả năng kiểm soát kịp thời dịch bệnh cúm A/H5N1 ở gia cầm bằng việc ứng dụng công nghệ di truyền ngược để lắp ráp nhân tạo nhanh chủng virus ứng viên cho sản xuất vaccine có hiệu quả phòng vệ với các biến chủng virus mới xuất hiện. Nghiên cứu cũng đã tối ưu hóa một số yếu tố công nghệ trong quy trình chuyển nhiễm hệ thống 6+2 plasmid đơn gen vào tế bào 293T cho tái tạo chủng virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp. Hai chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 (rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c) đã được tạo ra, cho thấy khả năng thích ứng nhân lên với hiệu suất cao trong trứng gà sạch có phôi (hiệu giá HA ≥ 1:1024 ở thế hệ P1-P5), có tính ổn định di truyền và kích thích sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tạo kháng thể ở gà sạch 3 ngày tuổi (100% gà tiêm kháng nguyên virus có hiệu giá kháng thể đạt HI ≥ 4 log2 ở tuần 2 và tuần 4 sau tiêm phòng).

Mục lục chi tiết:

• Mở đầu: 4 trang
• Chương 1. Tổng quan tài liệu: 34 trang
  • 1.1. Tổng quan về virus cúm A/H5N1
  • 1.2. Vaccine phòng chống cúm A/H5N1 ở gia cầm
  • 1.3. Di truyền của các clade virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam
  • 1.4. Áp dụng kỹ thuật di truyền ngược trong nghiên cứu phòng chống virus cúm A
• Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 25 trang
  • 2.1. Vật liệu nghiên cứu
  • 2.2. Địa điểm nghiên cứu
  • 2.3. Phương pháp nghiên cứu
    • 2.3.1. Phân lập sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34
    • 2.3.2. Thiết kế gen kháng nguyên HA và NA của virus A/H5N1 clade 1.1 và 2.3.2.1c
    • 2.3.3. Ghép nối các phân đoạn gen của virus cúm A vào plasmid pHW2000 tạo hệ thống plasmid đơn gen
    • 2.3.4. Chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào 293T để tái tạo virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
    • 2.3.5. Nhân giống virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong trứng gà sạch có phôi
    • 2.3.6. Phân lập chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
    • 2.3.7. Nuôi cấy và thích nghi chủng virus trong trứng gà sạch có phôi và xác định tính ổn định di truyền của chủng virus
    • 2.3.8. Tạo vaccine trong phòng thí nghiệm từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
    • 2.3.9. Xác định khả năng kích thích sinh miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu trên gà sạch 3 ngày tuổi của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
• Chương 3. Kết quả nghiên cứu: 50 trang
  • 3.1. Tách dòng sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 vào plasmid pHW2000
    • 3.1.1. Tách chiết RNA tổng số của chủng NIBRG-14 mang sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34
    • 3.1.2. Khuếch đại, xác định trình tự và chọn dòng sáu phân đoạn gen khung
• Chương 4. Bàn luận kết quả: 14 trang
• Kết luận và kiến nghị: 1 trang
• Các công trình đã công bố của tác giả: 1 trang.
• Tóm tắt nội dung luận án bằng tiếng Anh: 5 trang
• Tài liệu tham khảo: 16 trang