Luận án Nghiên cứu nuôi cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và khảo sát ảnh hưởng của một số elicitor lên sự tích lũy saponin

Tên luận án:

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SỰ TÍCH LŨY SAPONIN

Ngành:

SINH LÝ HỌC THỰC VẬT

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là một loài sâm đặc hữu của Việt Nam, nổi bật với hàm lượng dược chất saponin cao, vượt trội so với nhiều loài sâm quý khác. Các saponin này có nhiều tác dụng sinh học quý giá như bồi bổ sức khỏe, tăng cường sinh lực, điều hòa huyết áp, chống oxy hóa, hỗ trợ điều trị các bệnh ung thư, gan, thận, tiểu đường. Tuy nhiên, sâm Ngọc Linh đang đối mặt với nguy cơ cạn kiệt, được xếp vào danh mục sách đỏ, dẫn đến thiếu hụt nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm. Nuôi cấy rễ sâm in vitro mang lại tiềm năng lớn để sản xuất sinh khối trong thời gian ngắn, nhưng hàm lượng saponin trong rễ nuôi cấy thường thấp hơn đáng kể so với rễ tự nhiên.

Luận án này được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu nuôi cấy rễ thứ cấp (RTC) sâm Ngọc Linh và khảo sát ảnh hưởng của các elicitor lên sự tích lũy saponin. Cụ thể, nghiên cứu nhằm xác định các điều kiện nuôi cấy và môi trường tối ưu để rễ bất định (RBĐ) sâm Ngọc Linh phát triển, hình thành nhiều RTC, từ đó tạo nguồn sinh khối lớn và ổn định để nhân nhanh trong các hệ thống Bioreactor. Đồng thời, luận án cũng khảo sát các loại và nồng độ elicitor (SA, JA, ABA, CHN, YE) ảnh hưởng đến quá trình sản xuất ba saponin quan trọng (MR2, Rg1, Rb1) trong RTC sâm Ngọc Linh in vitro, tìm ra sự kết hợp và thời điểm bổ sung elicitor thích hợp để nâng cao hiệu quả. Các kết quả cho thấy RTC sâm Ngọc Linh hình thành tốt nhất từ mẫu RBĐ 2 cm tái sinh từ cuống lá, không bỏ phần mô cuống lá. Môi trường MS cải biên với tỷ lệ NH4+/NO3- 1/2, bổ sung 7 mg/L IBA, 0,5 mg/L BA và 30 g/L sucrose được xác định là tối ưu cho tăng trưởng. Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho tăng trưởng và tích lũy saponin là 56 ngày nuôi cấy (trong đó 45 ngày tối và 11 ngày sáng), ở nhiệt độ 22°C, trong 30 mL môi trường ở bình 250 mL và pH 5,3. Hệ thống Bioreactor tự tạo 3 L (chứa 1,5 L môi trường và 8 g RBĐ) cho kết quả tốt nhất. Về elicitor, JA và ABA ức chế sinh trưởng mạnh nhất, trong khi SA, YE và CHN ít ức chế hơn. Hàm lượng Rb1 đạt cao nhất với 50 µg/L JA, Rg1 với 100 µg/L JA, MR2 với 200 µg/L JA. Năng suất tổng hợp ba saponin cao nhất khi sử dụng 150 mg/L YE, và việc kết hợp YE với SA không hiệu quả bằng YE đơn lẻ. Thời điểm bổ sung 150 mg/L YE tối ưu là vào ngày thứ 40 của quá trình nuôi cấy. Nghiên cứu này cung cấp các dẫn liệu khoa học mới và thiết lập quy trình nuôi cấy tối ưu, góp phần giải quyết vấn đề khan hiếm nguồn nguyên liệu sâm Ngọc Linh cho ngành dược phẩm và thực phẩm.

Mục lục chi tiết:

• CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

  • 1. GIỚI THIỆU VỀ SÂM NGỌC LINH
  • 2. HỢP CHẤT SAPONIN CỦA SÂM NGỌC LINH
  • 3. NUÔI CẤY TẠO RỄ THỨ CẤP TỪ RỄ BẤT ĐỊNH
  • 4. ELICITOR VÀ SỰ KÍCH KHÁNG

• CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

  • 1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
    • 1.1. Nguồn mẫu
  • 2. PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
    • 2.1. Tối ưu cách chọn mẫu và môi trường nuôi cấy RTC từ nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh in vitro
      • 2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của cách cắt mẫu rễ bất định lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
      • 2.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp giữa auxin và cytokinin lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NH4+/NO3- trong môi trường MS lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.1.6. Khảo sát ảnh hưởng của các loại đường carbohydrate lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.1.7. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
    • 2.2. Tối ưu điều kiện nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh để tăng cường sự hình thành RTC và tích lũy saponin trong nuôi cấy in vitro
      • 2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
      • 2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của giai đoạn nuôi cấy tối và sáng lên sự tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
      • 2.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
    • 2.3. Tối ưu khả năng tích lũy saponin của RTC hình thành từ rễ bất định sâm Ngọc Linh nhờ tác động của các elicitor
      • 2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
      • 2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của abscisic acid lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của jasmonic acid lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh in vitro
      • 2.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý elicitor lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh
    • 2.4. Phương pháp xác định chỉ số tăng trưởng, tỷ lệ chất khô, tỷ lệ hình thành và tăng sinh của mẫu cấy
    • 2.5. Môi trường nuôi cấy
    • 2.6. Điều kiện nuôi cấy
  • 3. PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN
    • 3.1. Phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng
    • 3.2. Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
    • 3.3. Phương pháp xác định năng suất tổng hợp saponin
  • 4. PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT TẾ BÀO HỌC
  • 5. PHƯƠNG PHÁP THỐNG KÊ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

• CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

  • 1. TỐI ƯU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH TỪ NHỮNG MẪU RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO
    • 1.1. Tối ưu cách chọn mẫu và môi trường nuôi cấy RTC sâm Ngọc Linh
      • 1.1.1. Ảnh hưởng của cách cắt mẫu rễ bất định lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
      • 1.1.2. Ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
      • 1.1.3. Ảnh hưởng của việc kết hợp auxin với cytokinin lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh.
      • 1.1.4. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
      • 1.1.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ NH4+/NO3- trong môi trường MS lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
      • 1.1.6. Ảnh hưởng các loại đường carbohydrate lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
      • 1.1.7. Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
    • 1.2. Tối ưu điều kiện nuôi cấy RTC từ nuôi cấy RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
      • 1.2.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
      • 1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
      • 1.2.3. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
      • 1.2.4. Ảnh hưởng của giai đoạn nuôi cấy tối và sáng lên sự tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
      • 1.2.5. Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên sự tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
      • 1.2.6. Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
  • 2. TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY SAPONIN CỦA RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH
    • 2.1. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.1.1. Ảnh hưởng của các giai đoạn nuôi cấy lên sự tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro
      • 2.1.3. Ảnh hưởng của pH lên sự tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro
      • 2.1.4. Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy lên sự tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
    • 2.2. Ảnh hưởng của một số elicitor lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro
      • 2.2.1. Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ mẫu RBĐ in vitro
      • 2.2.2. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.2.3. Ảnh hưởng của abscisic acid lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.2.4. Ảnh hưởng của salicylic acid lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.2.5. Ảnh hưởng của jasmonic acid lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.2.6. So sánh tác động của các elicitor đơn lẻ lên sự tổng hợp saponin của RTC sâm Ngọc Linh
      • 2.2.7. Ảnh hưởng của việc kết hợp đồng thời salicylic acid và dịch chiết nấm men lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh in vitro
      • 2.2.8. Ảnh hưởng của thời gian bổ sung dịch chiết nấm men lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
• KẾT LUẬN
• KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC