Luận án Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển

Tên luận án:

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC NHẰM PHÁT TRIỂN VẮC-XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN

Ngành:

DI TRUYỀN HỌC

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Luận án "Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển" của tác giả Vũ Thị Bích Huyền, thuộc chuyên ngành Di truyền học, được thực hiện nhằm giải quyết thách thức lớn trong ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam: bệnh hoại tử gan thận do Vibrio parahaemolyticus gây ra. Bệnh này gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng và tỉ lệ chết cao (đến 90%), trong khi việc sử dụng kháng sinh thường xuyên dẫn đến kháng thuốc và dư lượng, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và sức khỏe người tiêu dùng. Do đó, việc phát triển vắc-xin, đặc biệt là vắc-xin nhược độc với khả năng bảo hộ cao và dài, là giải pháp bền vững.

Mục tiêu chung của nghiên cứu là tạo được chủng V. parahaemolyticus đột biến giảm độc lực có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cho cá, làm ứng viên cho sản xuất vắc-xin sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá biển nuôi lồng. Để đạt được mục tiêu này, luận án đã tiến hành phân lập và xác định 11 chủng V. parahaemolyticus gây bệnh từ 26 mẫu cá biển mắc bệnh tại các vùng biển miền Bắc Việt Nam, đồng thời phân tích đặc điểm hình thái, sinh hóa, độc lực, tính kháng kháng sinh và sự hiện diện của các gen độc tố toxR và tlh (kích thước đầy đủ lần lượt là 879 bp và 1254 bp), không chứa gen trh và tdh.

Nghiên cứu đã tuyển chọn thành công 09 dòng V. parahaemolyticus kháng rifampicin giảm độc lực từ 03 chủng dại, trong đó dòng L4650 thể hiện độ giảm độc lực cao nhất. Phân tích di truyền cho thấy sự xuất hiện của các đột biến sai khác nucleotide trong gen độc tố tlh và gen rpoB ở các dòng giảm độc lực so với chủng dại. Đáng chú ý, các đột biến dịch khung trong gen tlh ở các dòng A650, L4650 và L4200 đã làm thay đổi kích thước protein suy diễn.

Kết quả đánh giá cho thấy dòng L4650 đột biến giảm độc lực có tính ổn định cao về độc lực, an toàn tuyệt đối (tỉ lệ sống sót 100% khi tiêm liều 10⁵ CFU/ml) và khả năng tạo đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ trên cá mú chấm cam (Epinephelus coioides). Tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt cao, từ 96,91% đến 100% sau 15 ngày tiêm chủng và duy trì ở mức 93,33% đến 100% sau 6 tháng. Những phát hiện này khẳng định dòng V. parahaemolyticus L4650 là ứng viên tiềm năng để phát triển vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển nuôi lồng. Luận án cũng đề xuất các hướng nghiên cứu tiếp theo để làm sáng tỏ mối liên quan giữa đột biến gen và hiệu quả giảm độc lực, xác định lượng kháng thể và đánh giá hiệu quả bảo hộ trên các loài cá biển khác.

Mục lục chi tiết:

• CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

  • 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở một số loài cá
    • 1.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio
    • 1.1.2. Hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus
    • 1.1.3. Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin
    • 1.1.4. Gen rpoB và tính kháng rifampicin
    • 1.1.5. Kháng nguyên của vi khuẩn V. parahaemolyticus
  • 1.2. Bệnh hoại tử gan thận trên cá biển
    • 1.2.1. Triệu chứng
    • 1.2.2. Chẩn đoán và điều trị
  • 1.3. Vắc-xin và cơ chế miễn dịch chủ động
    • 1.3.1. Vắc-xin và phân loại vắc-xin cho cá
    • 1.3.2. Miễn dịch đặc hiệu ở cá xương
    • 1.3.3. Phương thức đưa vắc-xin vào cơ thể cá
  • 1.4. Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh cho cá
    • 1.4.1. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân vật lý
    • 1.4.2. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân hóa học
    • 1.4.3. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng kĩ thuật gen
  • 1.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận do cho cá
    • 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
    • 1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

• CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

  • 2.1. Vật liệu nghiên cứu
    • 2.1.1. Cá bệnh
    • 2.1.2. Cá thí nghiệm
    • 2.1.3. Vi khuẩn
    • 2.1.4. Hóa chất
    • 2.1.5. Thiết bị
  • 2.2. Phương pháp nghiên cứu
    • 2.2.1. Sơ đồ các bước thực hiện chính
    • 2.2.2. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá nghi mắc bệnh
    • 2.2.3. Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn
    • 2.2.4. Phương pháp nhuộm Gram
    • 2.2.5. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
    • 2.2.6. Phương pháp đánh giá đặc điểm hóa sinh, đặc tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn
    • 2.2.7. Phương pháp đánh giá độc lực của vi khuẩn
    • 2.2.8. Phương pháp xử lý vi khuẩn với rifampicin
    • 2.2.9. Phương pháp đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin
    • 2.2.10. Nhóm phương pháp sinh học phân tử
      • 2.2.10.1. Phương pháp thiết kế mồi
      • 2.2.10.2. Phương pháp tách DNA tổng số
      • 2.2.10.3. Phương pháp PCR khuếch đại gen, giải trình tự gen
    • 2.2.11. Phương pháp tin sinh
    • 2.2.12. Phương pháp đánh giá tính ổn định về độc lực và độ an toàn của dòng vi khuẩn giảm độc lực trên cá mú chấm cam
    • 2.2.13. Phương pháp đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng giảm độc lực trên cá mú
    • 2.2.14. Phương pháp xử lý số liệu.

• CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

  • 3.1. Phân lập vi khuẩn từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận
    • 3.1.1. Phân lập vi khuẩn Vibrio
    • 3.1.2. Phân tích đặc điểm sinh hóa của các vi khuẩn phân lập
    • 3.1.3. Xác định chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus bằng phương pháp phân tử
    • 3.1.4. Đánh giá khả năng gây bệnh cho cá mú của các mẫu vi khuẩn phân lập
    • 3.1.5. Phân lập, giải trình tự các gen độc tố toxR, tlh và gen rpoB các chủng vi khuẩn phân lập
  • 3.2. Kết quả tạo dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực
    • 3.2.1. Đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin
    • 3.2.2. Đánh giá đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn giảm độc lực
    • 3.2.3. So sánh trình tự gen toxR, tlh và rpoB của các dòng giảm độc lực và chủng vi khuẩn dại
      • 3.2.3.1. So sánh trình tự gen độc tố toxR và tlh của dòng giảm độc lực và chủng vi khuẩn dại
      • 3.2.3.2. So sánh trình tự rpoB của chủng dại với các dòng giảm độc lực
  • 3.3. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch, khả năng sinh trưởng của dòng vi khuẩn giảm độc lực
    • 3.3.1. Đánh giá tính ổn định độc lực, khả năng sinh trưởng của dòng giảm độc lực
    • 3.3.2. Xác định tính an toàn của dòng L4650
    • 3.3.3. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn giảm độc lực ở cá mú

• CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

  • 4.1. Kết luận
  • 4.2. Kiến nghị