Luận án Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn quanh nấm mục trắng thủy phân lignocellulose và khai thác gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật Metagenomics

Tên luận án:

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG KHU HỆ VI KHUẨN QUANH NẤM MỤC TRẮNG THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE VÀ KHAI THÁC GEN MÃ HÓA CELLULASE BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 9.42.02.01

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Luận án này tập trung vào việc nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn phân giải lignocellulose xung quanh nấm mục trắng và khai thác các gen mã hóa cellulase bằng kỹ thuật metagenomics, nhằm tìm kiếm các enzyme có giá trị ứng dụng trong công nghiệp sinh học. Lignocellulose, một nguồn sinh khối tự nhiên dồi dào, rẻ tiền và tái tạo, có tiềm năng lớn cho công nghiệp sinh học, nhưng quá trình chuyển hóa bằng enzyme sinh học còn gặp nhiều thách thức do chi phí cao, đặc biệt trong giai đoạn đường phân. Do đó, việc tìm kiếm các enzyme thủy phân cellulose hiệu quả là rất quan trọng.

Nấm mục trắng và đất xung quanh nấm mục trắng được xác định là hệ sinh thái nơi sự phân hủy lignocellulose diễn ra mạnh mẽ, với sự tham gia phối hợp của nấm và các cộng đồng vi khuẩn. Các vi khuẩn trong môi trường này được kỳ vọng sở hữu những đặc tính và enzyme chuyển hóa đặc biệt. Kỹ thuật metagenomics được áp dụng để đánh giá đa dạng thành phần loài vi sinh vật và sàng lọc các enzyme mã hóa cellulase với đặc tính mới mà không cần nuôi cấy.

Kết quả nghiên cứu đã xây dựng thành công bộ dữ liệu DNA đa hệ gen từ quần xã vi sinh vật đất xung quanh nấm mục trắng tại Vườn Quốc gia Cúc Phương, với dung lượng 51,82 Gb và xác định được 3.896.881 ORF. Phân tích chỉ ra rằng vi khuẩn chiếm ưu thế tuyệt đối (99,69% tổng số gen), trong đó ngành Proteobacteria là phổ biến nhất (75,68%), tiếp theo là Bacteroidetes (13,11%). Dựa trên cơ sở dữ liệu KEGG, 22.226 gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân lignocellulose đã được chú giải, bao gồm các enzyme tiền xử lý, cellulase và hemicellulase. Trong số đó, 8301 gen mã hóa cellulase được phân tích, với các nhóm endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase và 6-phospho-β-glucosidase. Đặc biệt, luận án đã biểu hiện thành công và tinh chế protein GH3S2 với độ tinh sạch 97,3%, xác định các tính chất động học (Km = 4,55 mM, Vmax = 4,91 U/mg) và ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại (Ca2+, Mg2+ tăng hoạt tính; Ni2+, Cu2+ giảm hoạt tính) cũng như glucose đến hoạt tính của enzyme. Đây là nghiên cứu đầu tiên về đa dạng vi khuẩn và enzyme phân giải lignocellulose bằng metagenomics tại rừng Quốc gia Cúc Phương, góp phần vào việc khai thác các enzyme có tiềm năng ứng dụng.

Mục lục chi tiết:

• MỞ ĐẦU

  • 1. Tính cấp thiết của luận án

  • 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án

  • 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

• CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

  • 1.1. Khái quát chung về lignocellulose

  • 1.2. Cellulase

  • 1.3. Nấm mục trắng và khu hệ vi sinh vật xung quanh khu nấm mục trắng thủy phân lignocellulose

  • 1.4. Metagenomic và một số công cụ tin sinh, cơ sở dữ liệu được sử dụng trong khai thác DNA đa hệ gen

• CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

  • 2.1. Vật liệu, hóa chất

  • 2.2. Phương pháp nghiên cứu

    • 2.2.1. Các phương pháp vi sinh và sinh học phân tử
    • 2.2.2. Các phương pháp hóa sinh protein
    • 2.2.3. Các phương pháp tin sinh học

• CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

  • 3.1. Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi khuẩn đất quanh khu nấm mục trắng

    • 3.1.1. Tách chiết, tinh sạch DNA đa hệ gen vi sinh vật đất
    • 3.1.2. Kết quả giải trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật đất
    • 3.1.3. Phân tích đa dạng vi sinh vật đất

  • 3.2. Nghiên cứu khai thác gen mã hóa lignocellulase

    • 3.2.1. Dự đoán chức năng DNA đa hệ gen của vi khuẩn đất
    • 3.2.2. Khai thác gen dựa trên kết quả chú giải bởi KEGG
    • 3.2.3. Khai thác gen dựa trên mô hình đại diện HMM
    • 3.2.4. Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật mang gen mã hóa lignocellulase

  • 3.3. Nghiên cứu khai thác và lựa chọn gen tiềm năng mã hóa cellulase

    • 3.3.1. Phân tích các vùng chức năng của cellulase
    • 3.3.2. Dự đoán mức độ biểu hiện của các gen cellulase
    • 3.3.3. Nghiên cứu lựa chọn gen mã hóa cellulase
    • 3.3.3.1. Dự đoán vùng bảo thủ của gen bằng BLASTP
    • 3.3.3.2. Dự đoán cấu trúc không gian và ước đoán vị trí gắn cơ chất của protein gh3s2
    • 3.3.3.3. Dự đoán một số tính chất của enzyme ứng viên

  • 3.4. Biểu hiện, tinh chế và nghiên cứu tính chất GH3S2

    • 3.4.1. Nghiên cứu biểu hiện gen gh3s2
    • 3.4.1.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET22b(+) mang gh3s2
    • 3.4.1.2. Nghiên cứu lựa chọn chủng biểu hiện GH3S2
    • 3.4.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự biểu hiện của GH3S2 trong E.coli Rosetta 1
    • 3.4.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến sự biểu hiện của GH3S2 trong E.coli Rosetta 1
    • 3.4.1.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG đến sự biểu hiện của GH3S2 trong E. coli Rosetta 1
    • 3.4.1.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ tế bào lúc cảm ứng đến sự biểu hiện của GH3S2 trong E. coli Rosetta 1
    • 3.4.1.7. Nghiên cứu xác định thời gian thu mẫu GH3S2 tối ưu sau cảm ứng
    • 3.4.2. Tinh chế protein GH3S2 bằng cột sắc ký ái lực
    • 3.4.3. Nghiên cứu tính chất của protein tái tổ hợp GH3S2
    • 3.4.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ bền nhiệt của enzyme GH3S2
    • 3.4.3.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền pH của enzyme GH3S2
    • 3.4.3.3. Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính của enzyme GH3S2
    • 3.4.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của glucose đến hoạt tính của enzyme GH3S2
    • 3.4.3.5. Đặc điểm động học của enzyme GH3S2

• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

  • KẾT LUẬN

  • KIẾN NGHỊ

  • NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ