Tên luận án:
SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT NAM
Ngành:
Công nghệ sinh học
Tóm tắt nội dung tài liệu:
Luận án tập trung vào việc khám phá các chất ức chế protease (PIs) mới từ vi sinh vật liên kết với hải miên, một nguồn tài nguyên sinh học biển tiềm năng cho các ứng dụng y dược. Nhận thấy rằng phần lớn các vi sinh vật này không nuôi cấy được, luận án đã ứng dụng kỹ thuật metagenomics kết hợp với giải trình tự gen thế hệ mới và tin sinh học để vượt qua hạn chế này, nhằm phát hiện và khai thác các gen mã hóa PIs.
Mục tiêu chính của nghiên cứu là phát hiện và sàng lọc các gen liên quan đến sinh tổng hợp PIs từ vi sinh vật liên kết hải miên thu nhận tại vùng biển miền Trung, Việt Nam, sau đó biểu hiện các gen chọn lọc in vitro và xác định hoạt tính. Các nội dung nghiên cứu bao gồm tách DNA tổng số từ vi sinh vật liên kết hải miên, phân tích dữ liệu metagenomics để đánh giá đa dạng sinh học và khai thác gen mã hóa PIs, cùng với nghiên cứu biểu hiện các gen này trong hệ *Escherichia coli* và *Pichia pastoris* để đánh giá hoạt tính ức chế protease của protein tái tổ hợp.
Những đóng góp mới của luận án bao gồm việc xây dựng thành công cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết với hải miên *Spheciospongia vesparium* (mẫu QT2) từ vùng biển Quảng Trị, Việt Nam, có ý nghĩa quan trọng trong bảo tồn nguồn gen và tiềm năng ứng dụng. Đặc biệt, một gen mới mã hóa PIs, được đặt tên là PI-QT, đã được thu nhận và biểu hiện thành công trong cả hai hệ thống *E. coli* và *P. pastoris*.
Kết quả cho thấy protein PI-QT tái tổ hợp từ *E. coli* có hoạt tính ức chế trypsin mạnh và α-chymotrypsin yếu, không ức chế thermolysin. Protein PI-QT thu hồi từ *P. pastoris* thể hiện hoạt tính ức chế cao hơn với trypsin, yếu hơn với α-chymotrypsin và rất yếu với thermolysin. Cả hai protein tái tổ hợp đều đạt độ tinh sạch trên 85%. Nghiên cứu cũng xác định rằng protein PI-QT có hoạt tính mạnh nhất ở 4°C, ổn định trong khoảng nhiệt độ 30-70°C và bất hoạt ở 100°C, đồng thời ổn định và hoạt tính cao trong dải pH 7-9. Các phát hiện này mở ra hướng ứng dụng tiềm năng của kỹ thuật metagenomics trong tìm kiếm các hợp chất sinh học từ tài nguyên biển và khuyến nghị hoàn thiện quy trình biểu hiện, thu hồi protein PI-QT để nghiên cứu khả năng ứng dụng thực tế.
Mục lục chi tiết:
-
MỞ ĐẦU
- 1. Tính cấp thiết của luận án
-
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
- 1.1. Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên
- 1.1.1. Giới thiệu về hải miên
- 1.1.2. Vi sinh vật liên kết hải miên
- 1.2. Sơ lược về metagenomics
- 1.3. Chất ức chế protease (PIs)
- 1.3.1. Sơ lược về protease
- 1.3.2. Chất ức chế protease và phân loại
- 1.3.3. Cơ chế hoạt động của PIs
- 1.3.4. Ứng dụng của chất ức chế protease
- 1.3.5. Tình hình nghiên cứu PIs từ vi sinh vật liên kết hải miên trong và ngoài nước
- 1.4. Hệ biểu hiện gen ngoại lai Escherichia coli và Pichia pastoris
-
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
- 2.1. Vật liệu nghiên cứu
- 2.1.1. Vật liệu
- 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
- 2.1.3. Hóa chất
- 2.1.4. Máy móc thiết bị
- 2.1.5. Dung dịch và môi trường sử dụng
- 2.2. Phương pháp nghiên cứu
- 2.2.1. Phương pháp tách DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên
- 2.2.2. Định danh hải miên bằng sinh học phân tử (Medlin et al., 1988)
- 2.2.3. Phân tích dữ liệu metagenomics
- 2.2.4. Tổng hợp gen PIs từ CSDL metagenomics hải miên và thiết kế plasmid mang gen PIs
- 2.2.5. Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện E. coli BL21(DE3)
- 2.2.6. Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện nấm men Pichia pastoris
- 2.2.7. Phương pháp xác định hoạt tính ức chế protease(Sapna., 2013; Jiang et al., 2011)
- 2.2.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PIs tái tổ hợp(Sapna., 2013).
- 2.2.9. Phân tích thống kê
-
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
- 3.1. Thu thập mẫu hải miên
- 3.1.2. Định danh hải miên QT2 bằng sinh học phân tử
- 3.2. Kết quả tách chiết DNA metagenome
- 3.2.1. Tách chiết DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị
- 3.3. Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 bằng tin sinh học
- 3.3.1. Lắp ráp reads của DNA metagenome
- 3.3.2. Kết quả dự đoán gen
- 3.3.3. Kết quả chú giải và phân loại chức năng gen
- 3.3.4. Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2
- 3.3.5. Khai thác gen có hoạt tính ức chế protease (PIs) dựa trên cơ sở dữ liệu (CSDL) metagenomics
- 3.4. Nghiên cứu biểu hiện gen ức chế protease (PIs) trong hệ Escherichia coli
- 3.4.1. Phân tích trình tự a xít amin và cây phân loại của protein PI-QT
- 3.4.2. Thiết kế vectơ biểu hiện pET-32a(+) mang gen PIs
- 3.4.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli chủng BL21(DE3)
- 3.4.4. Nghiên cứu điều kiện thích hợp nhất để thu protein tái tổ hợp PI-QT ở trạng thái tan cao nhất
- 3.4.5. Tinh sạch protein tái tổ hợp PI-QT trong E. coli và nhận diện bằng khối phổ
- 3.4.6. Hoạt tính của chất ức chế protease tái tổ hợp
- 3.5. Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp trong Pichia pastoris SMD1168
- 3.5.1. Thiết kế vectơ biểu hiện pPIC9/PI-QT
- 3.5.2. Tạo dòng tế bào Pichia pastoris SMD1168 mang gen PI-QT
- 3.5.3. Biểu hiện gen PI-QT trong nấm men P. pastoris SMD1168
- 3.5.4. Kết quả thử hoạt tính ức chế protease của protein PI-QT biểu hiện trong nấm men
- 3.5.5. Kết quả phát hiện chất ức chế protease bằng điện di trên gel SDS – PAGE có bổ sung cơ chất casein 0,1%
- 3.5.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện P. pastoris SMD 1168 [pPIC9/PI-QT]
- 3.5.7. Tinh sạch protein PI-QT tái tổ hợp biểu hiện trong P. pastoris qua cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharore 4B
- 3.5.8. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PI-QT
-
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ