Tên luận án:
TẠO DÒNG BÔNG (Gossypium hirsutum L.) CHỐNG CHỊU THUỐC TRỪ CỎ GLUFOSINATE VÀ GLYPHOSATE BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN QUA TRUNG GIAN Agrobacterium tumefaciens
Ngành:
Công nghệ sinh học
Tóm tắt nội dung tài liệu:
Luận án tiến sĩ này tập trung vào việc tạo ra các dòng bông (Gossypium hirsutum L.) có khả năng chống chịu thuốc trừ cỏ glufosinate và glyphosate thông qua kỹ thuật chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens. Đề tài xuất phát từ nhu cầu cấp thiết về kiểm soát cỏ dại trong canh tác bông, một tác nhân chính làm giảm năng suất và chất lượng, đồng thời tận dụng ưu thế của cây bông biến đổi gen trong việc tăng năng suất, giảm chi phí sản xuất và ô nhiễm môi trường.
Mục tiêu chính của nghiên cứu là chuyển thành công các gen EPSPS (kháng glyphosate) và gen bar (kháng glufosinate) vào giống bông Coker310, từ đó tạo ra các dòng bông chuyển gen có khả năng chống chịu cao (gấp hai lần liều lượng khuyến cáo) với các loại thuốc trừ cỏ này, làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống bông trong nước. Luận án đã đóng góp mới bằng việc đề xuất được dòng bông có khả năng tái sinh cao, tối ưu hóa quá trình phát sinh phôi soma từ mô sẹo, qua đó cải thiện hiệu quả chuyển gen.
Nghiên cứu đã xác định dòng Coker310FR có khả năng tái sinh rất cao, với 95,6% mô sẹo phát sinh phôi và 36,7% cây tái sinh không dị dạng trên môi trường tối ưu. Bốn vector chuyển gen tái tổ hợp (pCAMBIA1300:hpt-bar, pCAMBIA1300:hpt-EPSPS, pCB301:nptII-bar và pCB301:nptII-EPSPS) đã được tạo và biến nạp thành công vào vi khuẩn A. tumefaciens chủng C58/PGV2260. Các thông số tối ưu cho quy trình chuyển gen qua trung gian A. tumefaciens đã được xác định, bao gồm mật độ vi khuẩn OD600 0,75, thời gian lây nhiễm 10 phút, và thời gian đồng nuôi cấy 64 giờ ở nhiệt độ 22 °C.
Kết quả quan trọng là đã chọn lọc được hai dòng bông chuyển gen thế hệ T2 là B9 và BF17. Các dòng này mang một bản sao gen bar, thể hiện tính chống chịu cao và ổn định với thuốc trừ cỏ glufosinate (0,6 kg a.i./ha), di truyền gen chuyển theo quy luật Mendel, và không có sự khác biệt đáng kể về đặc điểm thực vật học hay khả năng mẫn cảm với bệnh hại so với giống bông nền Coker310 không chuyển gen. Các dòng chuyển gen EPSPS cũng được chọn lọc nhưng chỉ đạt mức chống chịu trung bình với glyphosate. Những kết quả này cung cấp vật liệu và quy trình quan trọng cho việc phát triển giống bông chống chịu thuốc trừ cỏ tại Việt Nam.
Mục lục chi tiết:
- CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
- 1.1 Sơ lược về cây bông
- 1.2 Thực trạng sản xuất và tiêu thụ bông trên thế giới
- 1.3 Cây trồng biến đổi gen chống chịu thuốc diệt cỏ
- 1.3.1 Cây trồng biến đổi gen chống chịu thuốc diệt cỏ
- 1.3.2 Cây bông biến đổi gen chống chịu thuốc diệt cỏ
- 1.4 Cây bông biến đổi gen ở Việt Nam
- 1.5 Thuốc diệt cỏ và gen chống chịu thuốc diệt cỏ
- 1.5.1 Thuốc diệt cỏ
- 1.5.2 Gen kháng kháng thuốc diệt cỏ
- 1.6 Chuyển gen thực vật qua trung gian vi khuẩn A. tumefaciens
- 1.6.1 Vi khuẩn A. tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật
- 1.6.2 Vector biểu hiện ở thực vật
- 1.6.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen
- 1.7 Chuyển gen qua trung gian A. tumefaciens trên cây bông
- 1.7.1 Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens
- 1.7.2 Chuyển gen cây bông qua A. tumefaciens ở Việt Nam
- 1.8 Sàng lọc và đánh giá cây chuyển gen
- 1.8.1 Sàng lọc tế bào, mô hoặc cây chuyển gen nhờ gen chỉ thị chọn lọc
- 1.8.2 Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chuyển gen
- 1.8.3 Đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen
- 1.8.4 Đánh giá tính chịu thuốc trừ cỏ của cây bông chuyển gen bar và EPSPS
- 1.8.5 Di truyền gen chuyển
- CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- 2.1 Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1 Chuyển gen bar và EPSPS vào cây bông
- Nội dung 1.1 Chọn lọc vật liệu có khả năng tái sinh cao phục vụ chuyển gen
- Nội dung 1.2 Tái cấu trúc các vector chuyển gen
- Nội dung 1.3 Xác định các thông số trong quy trình chuyển gen
- 2.2 Phương pháp nghiên cứu
- 2.2.1 Chuyển gen bar và EPSPS vào cây bông
- 2.2.1.1 Chọn lọc vật liệu có khả năng tái sinh cao phục vụ chuyển gen
- 2.2.1.2 Tái cấu trúc các vector chuyển gen
- 2.2.1.3 Xác định một số thông số chính trong quy trình chuyển gen EPSPS và bar vào cây bông qua trung gian A. tumefaciens
- 2.2.1.4 Chuyển gen bar và EPSPS vào giống Coker310 và Coker310FR
- 2.2.2 Chọn lọc dòng bông chuyển gen chống chịu thuốc diệt cỏ
- 2.2.2.1 Chọn lọc dòng bông chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử
- 2.2.2.2 Đánh giá tính chống chịu thuốc trừ cỏ của cây bông chuyển gen
- 2.2.3 Phân tích di truyền tính chống chịu thuốc diệt cỏ Basta, đặc điểm thực vật học và khả năng mẫn cảm với một số bệnh hại chính của cây bông chuyển gen thế hệ T2
- 2.3 Hoá chất
- 2.4 Máy móc và thiết bị
- 2.5 Phương pháp xử lý số liệu
- CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
- 3.1 Chuyển gen bar và EPSPS vào cây bông
- 3.1.1 Chọn lọc dòng Coker310FR có khả năng tái sinh cao
- 3.1.2 Tái cấu trúc vector chuyển gen mang gen chống chịu thuốc diệt cỏ gốc glyphosate và glufosinate, tạo chủng A. tumefaciens chứa plasmid tái tổ hợp
- 3.1.2.1 Tái cấu trúc vector chuyển gen mang gen bar chịu thuốc trừ cỏ gốc glufosinate
- 3.1.2.2 Tái cấu trúc vector chuyển gen mang gen EPSPS chống chịu thuốc diệt cỏ gốc glyphonate
- 3.1.2.3 Tạo chủng A. tumefaciens chứa plasmid tái tổ hợp
- 3.1.3 Xác định các thông số chuyển gen EPSPS và bar vào giống Coker310 thông qua A. tumefaciens
- 3.1.4 Chuyển các gen EPSPS và bar vào giống Coker310 và Coker310FR
- 3.2 Đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen chống chịu thuốc diệt cỏ
- 3.2.1 Chọn lọc cây chuyển gen bar chống chịu thuốc trừ cỏ gốc glufosinate
- 3.2.1.1 Đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen bar thế hệ T1
- 3.2.1.2 Đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen bar thế hệ T2
- 3.2.2 Chọn lọc cây chuyển gen EPSPS chống chịu thuốc trừ cỏ gốc glyphosate
- 3.2.2.1 Đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen EPSPS thế hệ T1
- 3.2.2.2 Đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen EPSPS thế hệ T2
- 3.3 Phân tích di truyền tính chống chịu thuốc diệt cỏ Glufosinate, các đặc điểm thực vật học và khả năng mẫn cảm với một số bệnh hại chính của cây bông chuyển gen thế hệ T2
- 3.3.1 Di truyền tính chống chịu thuốc diệt cỏ của các dòng chuyển gen bar
- 3.3.2 Đánh giá kiểu hình, đặc điểm nông học và tính mẫn cảm với bệnh hại của cây chuyển gen thế hệ T2
- KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
- 1. Kết luận
- 1- Dòng Coker310FR chọn lọc qua tái sinh liên tục ba thế hệ của giống bông Coker310 có khả năng tái sinh rất cao, thể hiện qua tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi là 95,6% và tỷ lệ cây tái sinh không dị dạng trên môi trường GR5 là 36,7%.
- 2- Bốn vector chuyển gen, gồm pCAMBIA1300:hpt-bar, pCAMBIA1300:hpt-EPSPS, pCB301:nptII-bar và pCB301:nptII-EPSPS được tái cấu trúc bằng cách chèn vùng P35S-EPSPS-TNos và PNos-bar-TNos vào vector biểu hiện thực vật pCB301:nptII và pCAMBIA1300:hpt. Kiểm tra hiện diện của 04 gen đích và gen độc lực virC khẳng định 04 vector chuyển gen được biến nạp thành công vào vi khuẩn A. tumefaciens chủng C58/PGV2260.
- 3- Nhiễm mẫu thân mầm giống bông Coker310 với A. tumefaciens mang gen EPSPS và bar ở mật độ, thời gian lây nhiễm, thời gian và nhiệt độ đồng nuôi khác nhau có ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ cảm ứng, sống sót và phát sinh phôi của mô sẹo chuyển gen. Kết quả tốt nhất đạt được khi lây nhiễm vi khuẩn với mật độ OD600 0,75 trong 10 phút, đồng nuôi cấy 64 giờ ở nhiệt độ 22 °C.
- 4- Tương tác giữa loại mẫu/giống với tác nhân chọn lọc ảnh hưởng đến tỷ lệ tái sinh và tỷ lệ cây mang gen chuyển. Hiệu quả chuyển vector pCAMBIA1300:bar vào mẫu lá mầm Coker310FR đạt cao nhất với 2,8% mô sẹo phát sinh phôi, 15,8 cây/mẫu được tái sinh, 76,0% số cây mang gen chuyển và 64,7% trong số đó hữu thụ. Hiệu quả chuyển vector pCB301:bar vào mẫu thân mầm Coker310FR đạt cao nhất với 2,1% mô sẹo phát sinh phôi, tái sinh được 20,6 cây/mẫu, 30,2% số cây mang gen chuyển và 82,5% trong số cây đó hữu thụ.
- 5- Chọn được 5 dòng T2 chuyển gen bar B1, B9, B18 và BF8, BF17 mang 1 bản sao, có hoạt động phiên mã của gen chuyển, cây sinh trưởng đồng đều và chống chịu thuốc diệt cỏ glufosinate cao (0,6 kg ai./ha).
- 6- Chọn được 5 dòng T2 chuyển gen EPSPS có 1 bản sao, có hoạt động phiên mã của gen chuyển và chống chịu trung bình với thuốc diệt cỏ glyphosate là E7, E8, E19, EF14 và EF25, không có dòng chống chịu cao.
- 7- Hai dòng bông chuyển gen T2 là B9 và BF17 mang 01 bản sao gen, di truyền gen chuyển theo quy luật Mendel, chống chịu cao với thuốc diệt cỏ glufosinate ở nồng độ 0,6 kg ai./ha, không sai khác về đặc điểm thực vật học và khả năng chống chịu bệnh hại so với giống bông nền Coker310 không chuyển gen.
- 2. Đề nghị
- 1- Sử dụng dòng Coker310FR để chuyển gen vào cây bông.
- 2- Sử dụng 4 vector biểu hiện gen chống chịu thuốc diệt cỏ vào giống bông khác hoặc cây trồng khác để tạo cây trồng có tính chống chịu thuốc diệt cỏ.
- 3- Áp dụng thông số trong quy trình chuyển gen qua trung gian A. tumefaciens cho các giống bông.
- 4- Đánh giá rủi ro ở quy mô sinh thái hạn chế, phát triển 2 dòng B9 và BF17 ở các thế hệ tiếp theo để đủ điều kiện làm vật liệu lai tạo giống tiến tới phổ biến giống.